Ablazione laser mirata nell'embrione di Saccharina latissima
Summary
La distruzione di cellule specifiche nell’embrione è un potente strumento per studiare le interazioni cellulari coinvolte nel destino cellulare. Il presente protocollo descrive le tecniche per l’ablazione laser di cellule bersaglio nell’embrione precoce dell’alga bruna Saccharina latissima.
Abstract
In Saccharina latissima, l’embrione si sviluppa come un foglio cellulare monostrato chiamato lamina o lama. Ogni cellula embrionale è facile da osservare, facilmente distinguibile dai suoi vicini e può essere presa di mira individualmente. Per decenni, l’ablazione laser è stata utilizzata per studiare lo sviluppo degli embrioni. Qui è stato sviluppato un protocollo per l’ablazione laser cellulare specifica per i primi embrioni dell’alga bruna S. latissima. Il lavoro presentato comprende: (1) la preparazione di embrioni di Saccharina , con una descrizione dei parametri critici, comprese le condizioni di coltura, (2) le impostazioni di ablazione laser e (3) il monitoraggio della successiva crescita dell’embrione irradiato utilizzando la microscopia time-lapse. Inoltre, vengono forniti dettagli sulle condizioni ottimali per il trasporto degli embrioni dalla piattaforma di imaging al laboratorio, che possono influenzare profondamente il successivo sviluppo dell’embrione. Le alghe appartenenti all’ordine Laminariales mostrano modelli di embriogenesi simili a Saccharina; questo protocollo può quindi essere facilmente trasferito ad altre specie in questo taxon.
Introduction
L’ablazione laser è stata utilizzata per decenni per studiare lo sviluppo dell’embrione. L’irradiazione delle cellule embrionali con un raggio laser consente di monitorare il potenziale rigenerativo e la modifica del lignaggio cellulare durante l’embriogenesi e studiare l’impatto dell’ablazione mirata sulla divisione cellulare e sul destino cellulare. Gli organismi modello utilizzati nei metodi di ablazione laser sono tipicamente animali, come insetti 1,2, nematodi 3,4, vertebrati 5,6 e occasionalmente piante 7,8. Inoltre, un approccio di micro-ablazione laser è stato utilizzato sull’alga marrone Fucus nel 1994 e nel 1998 per dimostrare il ruolo della parete cellulare nella fotopolarizzazione dell’embrione precoce 9,10.
Le alghe brune appartengono al gruppo Stramenopiles, divergente alla radice dell’albero eucariotico 1,6 miliardi di anni fa. Di conseguenza, sono filogeneticamente indipendenti da altri organismi multicellulari, come animali e piante11. Saccharina latissima appartiene all’ordine Laminariales, più comunemente noto come alghe, e sono tra i più grandi organismi sulla terra, raggiungendo dimensioni di oltre 30 m. Saccharina sp. è una grande alga utilizzata per molte applicazioni come alimenti e mangimi, e i suoi polisaccaridi sono estratti per l’uso nelle industrie agricole, farmacologiche e cosmetiche in tutto il mondo12, 13. La sua coltivazione, principalmente in Asia e più recentemente in Europa, richiede la preparazione di embrioni negli incubatoi prima di rilasciare il novellame in mare aperto. Come tutte le alghe, ha un ciclo di vita bifasico composto da una fase gametofita microscopica, durante la quale un gametofito aploide cresce e produce gameti per la fecondazione, e una fase sporofita macroscopica diploide, in cui una grande lama planare si sviluppa dalla sua tenuta attaccata al fondo marino o alle rocce. Lo sporofito rilascia spore aploidi alla maturità, completando così il ciclo di vita 14,15,16.
S. latissima presenta alcune interessanti caratteristiche morfologiche17. Il suo embrione si sviluppa come un foglio planare monostrato 15,18,19 prima di acquisire una struttura multistrato che coincide con l’emergere di diversi tipi di tessuto. Inoltre, Laminariales è uno dei pochi taxa di alghe brune i cui embrioni rimangono attaccati al loro tessuto gametofito materno (Desmarestiales e Sporochnales fanno anche15). Questa caratteristica offre l’opportunità di studiare il ruolo del tessuto materno in questo processo di sviluppo e confrontare i meccanismi di controllo materno nelle alghe brune con quelli negli animali e nelle piante.
Questo articolo presenta il primo protocollo completo per l’ablazione laser in un embrione di alghe precoce. Questo protocollo che coinvolge la tecnica UV ns-pulsed provoca la distruzione specifica di singole cellule embrionali per studiare i loro rispettivi ruoli durante l’embriogenesi. La procedura offre un approccio affidabile per studiare le interazioni cellulari e il destino cellulare durante l’embriogenesi nei Laminariales.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ablazione laser cellulare locale consente l’ablazione temporale e spaziale con un alto livello di precisione. Tuttavia, la sua efficienza può essere ostacolata dalla non accessibilità delle cellule bersaglio; ad esempio, tutte le cellule sono di un embrione tridimensionale. Questo protocollo è stato sviluppato sull’embrione dell’alga Saccharina latissima, che sviluppa una lamina monostrato in cui tutte le cellule possono essere facilmente distinte e distrutte individualmente con un raggio laser.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La borsa di dottorato di S.B. è finanziata dalla Regione Bretagne (numero di sovvenzione ARED COH20020) e dall’Università della Sorbona. I.T.is borsa di dottorato è finanziata dalla Regione Bretagna (numero di sovvenzione ARED COH18020) e dall’Università norvegese NMBU. Questo progetto ha ricevuto un sostegno finanziario dal CNRS attraverso i programmi interdisciplinari miti. MRic è membro dell’infrastruttura nazionale France-BioImaging sostenuta dall’Agenzia Nazionale Francese per la Ricerca (ANR-10-INBS-04).
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
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