الاستئصال بالليزر المستهدف في جنين السكرينا لاتيسيما
Summary
تدمير خلايا معينة في الجنين هو أداة قوية لدراسة التفاعلات الخلوية المشاركة في مصير الخلية. يصف هذا البروتوكول تقنيات الاستئصال بالليزر للخلايا المستهدفة في الجنين المبكر للطحالب البنية Saccharina latissima.
Abstract
في Saccharina latissima، يتطور الجنين كورقة خلية أحادية الطبقات تسمى الصفيحة أو الشفرة. من السهل ملاحظة كل خلية جنينية ، ويمكن تمييزها بسهولة عن جيرانها ، ويمكن استهدافها بشكل فردي. لعقود من الزمان ، تم استخدام الاستئصال بالليزر لدراسة تطور الجنين. هنا ، تم تطوير بروتوكول للاستئصال بالليزر الخاص بالخلايا للأجنة المبكرة للطحالب البنية S. latissima. يتضمن العمل المعروض: (1) إعداد أجنة السكرينا ، مع وصف للمعلمات الحرجة ، بما في ذلك ظروف الزرع ، (2) إعدادات الاستئصال بالليزر ، و (3) مراقبة النمو اللاحق للجنين المشعع باستخدام المجهر بفاصل زمني. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير تفاصيل حول الظروف المثلى لنقل الأجنة من منصة التصوير إلى المختبر ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل عميق على تطور الجنين اللاحق. الطحالب التي تنتمي إلى رتبة Laminariales تعرض أنماط تكوين جنيني مشابهة ل Saccharina ؛ وبالتالي يمكن نقل هذا البروتوكول بسهولة إلى أنواع أخرى في هذا التصنيف.
Introduction
تم استخدام الاستئصال بالليزر لعقود لدراسة تطور الجنين. إن تشعيع خلايا الجنين بشعاع ليزر يجعل من الممكن مراقبة إمكانات التجدد وتعديل سلالة الخلية أثناء تكوين الجنين والتحقيق في تأثير الاستئصال المستهدف على انقسام الخلايا ومصير الخلية. الكائنات الحية النموذجية المستخدمة في طرق الاستئصال بالليزر هي عادة ، مثل الحشرات 1,2 ، والديدان الخيطية3,4 ، والفقاريات5,6 ، وأحيانا النباتات 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام نهج الاستئصال الدقيق بالليزر على الطحالب البنية Fucus في عامي 1994 و 1998 لإثبات دور جدار الخلية في الاستقطاب الضوئي للجنين المبكر 9,10.
تنتمي الطحالب البنية إلى مجموعة Stramenopiles ، التي تباعدت في جذر شجرة حقيقية النواة منذ 1.6 مليار سنة. ونتيجة لذلك ، فهي مستقلة من الناحية الفيلولوجية عن الكائنات الحية متعددة الخلايا الأخرى ، مثل الحيوانات والنباتات11. ينتمي Saccharina latissima إلى رتبة Laminariales ، والمعروفة أكثر باسم عشب البحر ، وهي من بين أكبر الكائنات الحية على وجه الأرض ، حيث تصل أحجامها إلى أكثر من 30 مترا. Saccharina sp. هي أعشاب بحرية كبيرة تستخدم للعديد من التطبيقات مثل الأغذية والأعلاف ، ويتم استخراج السكريات المتعددة لاستخدامها في الصناعات الزراعية والدوائية والتجميلية في جميع أنحاء العالم12 ، 13. وتتطلب زراعته، وخاصة في آسيا ومؤخرا في أوروبا، إعداد الأجنة في المفرخات قبل إطلاق الأحداث في البحر المفتوح. مثل جميع عشب البحر ، لديها دورة حياة ثنائية الطور تتكون من مرحلة أمشاج مجهرية ، تنمو خلالها أمشاج فردية وتنتج أمشاج للإخصاب ، ومرحلة بوغية مجهرية ثنائية الصبغيات ، حيث تتطور شفرة مستوية كبيرة من ثباتها المرتبط بقاع البحر أو الصخور. يطلق البوغي جراثيم فردية عند النضج ، وبالتالي يكمل دورة الحياة 14،15،16.
يقدم S. latissima بعض الميزات المورفولوجية المثيرة للاهتمام17. يتطور جنينها كورقة مستوية أحادية الطبقات15،18،19 قبل الحصول على بنية متعددة الطبقات تتزامن مع ظهور أنواع مختلفة من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، Laminariales هي واحدة من الأصناف الوحيدة من الطحالب البنية التي تظل أجنتها مرتبطة بأنسجتها الأمومية (Desmarestiales و Sporochnales تفعل15 أيضا). توفر هذه الميزة الفرصة لدراسة دور أنسجة الأمهات في هذه العملية التنموية ومقارنة آليات مراقبة الأم في الطحالب البنية مع تلك الموجودة في الحيوانات والنباتات.
تقدم هذه المقالة أول بروتوكول كامل للاستئصال بالليزر في جنين عشب البحر المبكر. ينتج عن هذا البروتوكول الذي يتضمن تقنية نبضات الأشعة فوق البنفسجية NS تدميرا محددا لخلايا الجنين الفردية لدراسة أدوار كل منها أثناء تكوين الجنين. يوفر هذا الإجراء نهجا موثوقا به للتحقيق في تفاعلات الخلايا ومصير الخلايا أثناء التكوين الجنيني في Laminariales.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح الاستئصال بالليزر الخلوي المحلي بالاستئصال الزماني والمكاني بمستوى عال من الدقة. ومع ذلك ، يمكن أن تعرقل كفاءتها عدم إمكانية الوصول إلى الخلايا المستهدفة ؛ على سبيل المثال ، جميع الخلايا هي من جنين ثلاثي الأبعاد. تم تطوير هذا البروتوكول على جنين الطحالب Saccharina latissima، التي تطور صف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل منحة الدكتوراه من S.B. من قبل Region Bretagne (رقم منحة ARED COH20020) وجامعة السوربون. يتم تمويل منحة الدكتوراه I.T.is من قبل Region Bretagne (رقم منحة ARED COH18020) وجامعة NMBU النرويجية. وقد تلقى هذا المشروع دعما ماليا من المركز الوطني للبحث العلمي من خلال برامج MITI المتعددة التخصصات. MRic هي عضو في البنية التحتية الوطنية France-BioImaging التي تدعمها الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-10-INBS-04).
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. . The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B., Boutet, A., Schierwater, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology – Established and Emerging. , 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. , 37-59 (2018).
- Bartsch, I., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. , 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -. G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
