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Engineering

Imaging chimico multiplex basato sulla microscopia a dispersione Raman stimolata a banda larga

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/63709
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,2, 1,2
1Dipartimento di Fisica, Politecnico di Milano, 2Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

Summary

Presentiamo un protocollo per acquisire immagini chimiche con microscopia a diffusione Raman stimolata a banda larga (SRS). Basato su un microscopio SRS che opera con rilevamento differenziale multicanale-lock-in, il protocollo descrive la preparazione del campione, la regolazione dell'apparato SRS e la chemiometria per districare diversi costituenti di campioni chimicamente eterogenei.

Abstract

La microscopia A scattering Raman stimolato (SRS) è una tecnica ottica non lineare per l'imaging chimico privo di etichette. Questo strumento analitico fornisce mappe chimiche ad alta velocità e ad alta risoluzione spaziale di campioni sottili interrogando direttamente le loro vibrazioni molecolari. Nella sua implementazione standard, la microscopia SRS è a banda stretta e forma immagini con una sola frequenza vibrazionale alla volta. Tuttavia, questo approccio non solo ostacola la specificità chimica di SRS, ma trascura anche la ricchezza di informazioni codificate all'interno degli spettri vibrazionali.

Queste limitazioni possono essere superate dalla banda larga SRS, un'implementazione in grado di estrarre uno spettro vibrazionale per pixel dell'immagine in parallelo. Ciò fornisce dati iperspettrali che, se abbinati all'analisi chemiometrica, massimizzano la quantità di informazioni recuperate dal campione. Pertanto, l'SRS a banda larga migliora la specificità chimica del sistema, consentendo la determinazione quantitativa della concentrazione dei diversi costituenti di un campione. Qui, riportiamo un protocollo per l'imaging chimico con microscopia SRS a banda larga, basato su un microscopio SRS costruito in casa che opera con un rilevamento dell'amplificatore differenziale multicanale personalizzato. Discute la preparazione del campione, l'allineamento dell'apparato SRS e l'analisi chemiometrica. Acquisendo spettri Raman vibrazionali, il protocollo illustra come identificare diverse specie chimiche all'interno di una miscela, determinandone le concentrazioni relative.

Introduction

La microscopia Raman è una potente tecnica di imaging che fornisce ricche mappe chimiche misurando lo scattering Raman1, un processo radiativo anelastico che ha origine da molecole che vibrano in risposta alla luce incidente 2,3. Ogni pixel di una mappa Raman contiene uno spettro che trasporta informazioni dirette sulla composizione chimica e sulla struttura del campione, risultando in immagini con contrasto vibrazionale intrinseco. Ad oggi, la microscopia Raman è il punto di riferimento per gli studi di microspettroscopia delle vibrazioni molecolari in quanto nessun'altra tecnica di imaging può produrre immagini con elevata specificità chimica e alta risoluzione spaziale4. Nonostante la sua eccezionale specificità chimica, l'efficienza di generazione dello scattering Raman è bassa, richiedendo tempi di permanenza dei pixel prolungati o eccitazione ad alta potenza, portando, rispettivamente, a bassi tassi di acquisizione e incompatibilità con campioni sensibili.

Questa singola carenza di microscopia Raman ha portato i ricercatori ad applicare lo scattering Raman coerente 5,6,7,8,9 come fonte di contrasto per la microscopia. Si tratta di un processo ottico non lineare che migliora la risposta vibrazionale di diversi (fino a sette) ordini di grandezza, consentendo così l'imaging chimico ad alta velocità 10,11,12,13. In particolare, le due tecniche di scattering Raman coerenti più impiegate sono lo scattering Raman anti-Stokes (CARS)14 e lo scattering Raman stimolato (SRS)15. A differenza di CARS, SRS mostra una dipendenza lineare dalla concentrazione di molecole risonanti. È immune allo sfondo non consonante, un effetto non lineare estraneo a qualsiasi transizione vibrazionale ma distorsivo alle forme lorentziane caratteristiche degli spettri Raman delle vibrazioni molecolari16,17. Pertanto, la microscopia SRS produce informazioni Raman autentiche che consentono l'analisi quantitativa diretta delle immagini.

SRS è un processo ottico non lineare di terzo ordine che fornisce informazioni dirette sui legami chimici di un campione. Ha origine dalla sovrapposizione spaziotemporale di due campi ottici generalmente nella regione spettrale del vicino infrarosso, vale a dire la pompa e lo Stokes a frequenza ωpu e ωS, rispettivamente 10,11,18. Questa sovrapposizione genera un battito alla Ω di detuning della frequenza di Stokes della pompa = ωpu-ω S. Quando Ω corrisponde a una vibrazione molecolare ΩR, la molecola risuona, causando un trasferimento di energia coerente tra i campi luminosi e la molecola. Di conseguenza, la molecola raggiunge uno stato vibrazionalmente eccitato. Questo processo può essere monitorato misurando l'annichilazione dei fotoni della pompa (un segnale noto come perdita di Raman stimolata [SRL]) o l'amplificazione concomitante dei fotoni di Stokes (un processo noto come guadagno Raman stimolato [SRG]). SRG e SRL sono piccoli segnali (ΔI) che si trovano sopra uno sfondo intenso e fluttuante (I). Poiché i valori tipici del segnale SRS (ΔI/I) sono nell'intervallo 10-6-10-4, il rumore laser può facilmente oscurarlo. Per mitigare gli effetti dannosi del rumore laser sul rapporto segnale-rumore (SNR) e di conseguenza sulla velocità di imaging, il rilevamento SRS si basa su tecniche di trasferimento della modulazione (ad esempio, amplificatori lock-in, circuiti risonanti o mediatori box-car) ad alte frequenze di modulazione (>1 MHz), dove il rumore laser raggiunge i suoi valori minimi 15,19,20.

La microscopia SRS convenzionale impiega una pompa a banda stretta (≈10 cm−1) e impulsi Stokes per produrre immagini chimiche a una singola frequenza vibrazionale, consentendo l'imaging a velocità video con tempi di permanenza dei pixel a partire da ≈100 ns21,22. Tuttavia, poiché la microscopia SRS a banda stretta forma mappe chimiche scansionando sequenzialmente il campione solo a poche frequenze vibrazionali, le sue informazioni sono limitatea 23. Le immagini SRS con uno o due contrasti vibrazionali potrebbero non essere sufficienti per differenziare le specie chimiche con bande Raman sovrapposte, specialmente all'interno di sistemi eterogenei. Pertanto, il microscopio paradigmatico SRS a banda stretta non sfrutta appieno il potenziale di SRS, perché indagare una manciata di frequenze vibrazionali ostacola la sua specificità chimica e trascura la ricchezza di informazioni codificate all'interno degli spettri vibrazionali. Inoltre, la scansione sequenziale del campione a frequenze diverse si traduce in tempi di permanenza dei pixel estesi che possono innescare il fotodanno e impedire una rigorosa coregistrazione spaziale tra immagini consecutive, portando a artefatti di movimento.

Contrariamente alla sua controparte a banda stretta, la microscopia SRS a banda larga recupera uno spettro vibrazionale per pixel ad ogni scansione del campione 10,12,24. Pertanto, l'SRS a banda larga fornisce immagini iperspettrali con una rigorosa coregistrazione spaziale di diversi contrasti vibrazionali, consentendo un'analisi rigorosa dei dati. Questo non solo rivela i costituenti chimici del campione attraverso gli spettri Raman, ma aiuta anche a determinare le loro concentrazioni relative. A seconda di come vengono acquisiti gli spettri, la microscopia SRS a banda larga è classificata come SRS iperspettrale o SRS multiplex. Nella SRS iperspettrale, lo spettro SRS per punto scansionato del campione viene acquisito in sequenza (cioè, viene recuperato spazzando la frequenza di detuning Ω), costruendo uno spettro SRS impilando insieme i segnali SRS a turni Raman consecutivi. Lo spettro Raman viene misurato simultaneamente in diverse modalità vibrazionali in multiplex SRS. Pertanto, l'approccio SRS multiplex combina un impulso a banda stretta modulato con un impulso a banda larga per pilotare il segnale SRS a frequenze diverse e utilizza un rilevatore multicanale con una sensibilità paragonabile a quella di SRS a banda stretta per rilevare gli spettri SRS.

Questo documento presenta un protocollo per produrre mappe chimiche di campioni eterogenei utilizzando la microscopia SRS multiplex. Uno schema del microscopio SRS impiegato in questo protocollo è raffigurato in Figura 1 e descritto in dettaglio altrove 25,26,27. In breve, un laser a fibra Yb bloccato in modalità commerciale, che produce impulsi 140 fs centrati a 1040 nm, con una potenza media di 10 W e una frequenza di ripetizione di 80 MHz, guida il microscopio SRS a banda larga. Uno splitter a fascio polarizzatore (PBS) separa il fascio fondamentale in due rami. Per produrre gli impulsi stokes a banda stretta, un ramo con 4 W del fascio fondamentale viene inviato a un etalon che genera un fascio a banda stretta (≈15 cm-1), che viene poi modulato a 1,6 MHz con un modulatore ottico acustico (AOM). La frazione rimanente con 6 W del fascio fondamentale è raddoppiata in frequenza con un cristallo di triborato di litio (LBO) di 2,8 mm di spessore, tagliato per la corrispondenza di fase di tipo I (θ = 90°, φ = 13,8°). La seconda generazione armonica risultante a 520 nm viaggia verso una cavità piegata a X per pompare un oscillatore ottico parametrico (OPO), un dispositivo che utilizza un cristallo LBO di 3,0 mm di spessore (corrispondenza di fase di tipo I, θ = 90 °, φ = 9,8 °) come mezzo attivo per fornire una radiazione ottica a banda larga sintonizzabile all'interno della regione spettrale 680-910 nm (Figura 2). Questi impulsi a banda larga fungono da pompa negli esperimenti SRS e si propagano a un compressore prismatico per precompensare gli effetti di dispersione indotti dall'obiettivo del microscopio.

Dopo la fase di compressione, una piastra d'onda λ/2, combinata con una piastra birifrangente YVO4 , produce due repliche polarizzate ortogonalmente la cui sottrazione elettronica sul piano di rilevamento annulla il rumore della pompa a banda larga. Uno specchio dicroico combina la pompa e i fasci di Stokes e li invia a un microscopio verticale. Un obiettivo ad immersione in acqua con un'apertura numerica (NA) di 1,27 focalizza la luce sul campione, mentre un obiettivo ad immersione in olio con un NA di 1,4 lo raccoglie. Prima della fase di rilevamento, un filtro a passaggio corto (SPF) rimuove lo Stokes modulato, mentre un reticolo di diffrazione operante in configurazione Littrow disperde la pompa a banda larga trasmessa. Un secondo PBS2 separa le repliche della pompa e un obiettivo le focalizza su due array di fotodiodi. I segnali provenienti da questi array di fotodiodi vengono sottratti elettronicamente e inviati a un amplificatore di blocco multicanale (M-LIA) costruito in casa. Il segnale demodulato viene quindi normalizzato dalle letture in corrente continua (DC) di uno degli array di fotodiodi, producendo così lo spettro SRL.

Come esperimento esemplare, immaginiamo miscele di diversi noti scatterer Raman, ognuno con uno spettro Raman unico. Pertanto, il protocollo inizia descrivendo come preparare i campioni di riferimento. Mentre rileviamo SRL, continuiamo a spiegare come ottenere impulsi Stokes a banda stretta e impostare la sorgente ottica che eroga gli impulsi della pompa a banda larga (≈250 cm-1), vale a dire, l'OPO costruito in casa. Il protocollo mostra l'allineamento e l'ottimizzazione dei fasci ottici, descrivendo parametri critici come la potenza e gli spettri dello Stokes a banda stretta e della pompa a banda larga. Il protocollo descrive in dettaglio il percorso ottico della pompa a banda larga perché richiede particolari elementi ottici. Spiega anche come trovare la sovrapposizione spaziotemporale tra gli impulsi pompa-Stokes e mostra un modo pratico per determinare il rumore di intensità relativa (RIN), che a sua volta aiuta a definire la migliore frequenza di modulazione per gli esperimenti SRS. Quindi, spieghiamo il principio di funzionamento e la calibrazione della catena di rilevamento. Infine, il protocollo mostra il processo di acquisizione dei dati, la chemiometria e la pipeline di elaborazione delle immagini.

Protocol

1. Preparazione del campione

NOTA: Questo protocollo descrive il recupero delle mappe di concentrazione e degli spettri SRS caratteristici di miscele chimicamente eterogenee.

  1. Per preparare il campione, estrarre 2 μL da una sospensione acquosa di microsfere di polimetilmetacrilato (PMMA) (vedere la Tabella dei materiali) e versare la frazione di 2 μL su un coperchio del microscopio.
    1. Con una punta della pipetta pulita, estrarre 2 μL da una sospensione acquosa di microsfere di polistirene (PS) e combinarla con la sospensione in PMMA sul coperchio. Utilizzando una punta della pipetta, mescolare delicatamente la sospensione e lasciarla asciugare per 24 ore.
      NOTA: è importante abbinare attentamente la concentrazione delle sospensioni di microsfere per evitare quantità sproporzionate di microsfere sulla superficie del campione. Il diametro delle perle PS e PMMA è rispettivamente di 10 e 6 μm. Queste dimensioni permettono di dimostrare l'elevata risoluzione spaziale del microscopio senza compromettere l'efficienza generazionale di SRS.
  2. Sopra lo strato piatto e bianco di perline che apparirà quando l'acqua si asciuga, aggiungere 20 μL di dimetilsolfossido (DMSO) e poi 20 μL di olio d'oliva puro.
  3. Applicare lo smalto per unghie sui bordi di un secondo coverslip del microscopio. Posizionare il coverslip sulla miscela, con lo smalto rivolto verso il basso, applicando una pressione sufficiente per sigillarlo. Lasciare asciugare.
    NOTA: la Figura 3 mostra risultati esemplari ottenuti con questi passaggi. Se adeguatamente sigillato, questo campione dovrebbe durare fino a tre mesi.

2. Ottimizzazione della pompa e delle travi Stokes

  1. Accendi il laser e lascia che raggiunga l'equilibrio termico. Applicare una dispersione di ritardo di gruppo negativo (GDD) di GDD = -6.000 fs2 al fascio fondamentale.
    NOTA: questo valore GDD è fondamentale per pilotare correttamente l'OPO ed è ottimale per questa configurazione, ma probabilmente varierà nei diversi sistemi. Il GDD negativo può essere introdotto attraverso coppie di grigliati, compressori prismatici o modellatori di impulsi basati su modulatori di luce spaziale28.
  2. Dividere il laser fondamentale con un beamsplitter polarizzante (PBS1) in due rami. Per ottenere gli impulsi stokes a banda stretta, guidare un ramo con 4 W a un etalon. Ruotare leggermente l'etalon fino a ottenere una stretta linea spettrale e centrata al picco dello spettro degli impulsi (vedere la curva rossa in Figura 2).
    NOTA: Questo etalon ha una finezza effettiva di 29 e un intervallo spettrale libero di 29,8 nm a 1.040 nm.
  3. Per ottenere impulsi di Stokes modulati, inviare il fascio a banda stretta a un modulatore acusto-ottico.
    NOTA: come mostrato nella Figura 4A, il fascio diffratto del primo ordine sperimenta una modulazione del 100%, mentre l'ordine zero solo del 50%. Pertanto, è preferibile utilizzare il primo ordine per evitare di illuminare il campione con un forte fascio non modulato che potrebbe indurre il fotodanno del campione senza generare alcun segnale SRS.
    1. Per ottimizzare l'efficienza di modulazione, modificare la distanza tra gli obiettivi f1 e f2 (Figura 4B). Misurare il fascio modulato con un fotodiodo e registrarne il profilo con un oscilloscopio.
    2. Modificare la distanza tra f1 e f2 fino a raggiungere il massimo contrasto tra l'ampiezza e la linea di base delle letture dell'oscilloscopio.
      NOTA: Questa coppia di lenti non funziona come un collimatore, ma piuttosto crea un punto focale efficace sul cristallo dell'AOM.
    3. Posizionare una terza lente f3 per mettere a punto la vita del fascio di Stokes, consentendo di modificare il volume di interazione sul piano focale del microscopio e, di conseguenza, di ottimizzare il segnale SRS.
      NOTA: Il fascio di Stokes è stato modulato a 1,6 MHz in questo protocollo.
  4. Focalizzare i restanti 6 W della potenza ottica del fascio fondamentale su un cristallo di triborato di litio (LBO) (LBO1, θ = 90°, φ = 13,8°) per raddoppiare in frequenza il fascio fondamentale attraverso la seconda generazione armonica (SHG) (Figura 5A).
    1. Per massimizzare l'efficienza SHG, ruotare leggermente il cristallo, variando l'angolo di φ (Figura 5B). Ottimizza LBO1 per ottenere almeno 2,5 W di SHG.
  5. Regolare l'angolo di φ di LBO2 per massimizzare l'efficienza di generazione del fascio di segnale.
    NOTA: le lunghezze focali degli obiettivi f1, f2 e f3 sono state scelte con cura per abbinare in modalità il fascio SHG con la cavità OPO. Pertanto, le lunghezze focali di questi obiettivi varieranno in diverse configurazioni. A causa della dispersione residua nella cavità OPO, un leggero cambiamento nella lunghezza della cavità induce uno spostamento dello spettro del fascio di segnale.
    1. Regolare la lunghezza della cavità per ottenere uno spettro di pompa che, insieme allo Stokes a banda stretta a 1.040 nm, può produrre un detuning di frequenza entro 1.373-5.090 cm-1. Questa gamma copre le vibrazioni nella regione spettrale di allungamento CH (2.800-3.050 cm-1). Vedere gli spettri blu nella Figura 2.
  6. Per compensare gli effetti di dispersione indotti dall'obiettivo del microscopio di eccitazione, inviare la pompa a banda larga a un compressore prismatico. Immettere la pompa nel prisma A attraverso il suo apice e guidare la pompa dispersa verso l'apice del prisma B. Definire la quantità di dispersione negativa necessaria, quindi impostare la distanza tra gli apici L dei prismi di conseguenza.
    NOTA: la Figura 6 mostra la disposizione dei prismi29. In questo caso, la compensazione è stata fissata per GDD ≈ -12.800 fs2; quindi L = 1,26 m.
    1. Usa prismi tagliati a Brewster.
      1. Assicurarsi che la polarizzazione del fascio della pompa si trovi all'interno dei piani triangolari dei prismi (facce non lucidate superiore/inferiore).
      2. Assicurarsi che l'angolo di incidenza θin del fascio della pompa corrisponda all'angolo di Brewster.
      3. Assicurarsi che la faccia di uscita del prisma A sia parallela alla faccia di ingresso del prisma B.
    2. Per stimare il GDD dell'impulso a banda larga da compensare, misurare il segnale SRS ad una singola lunghezza d'onda λ1, registrando il ritardo temporale τ1 tra pompa-Stokes al quale si ottiene il massimo SRS(λ1). Ripetere questa procedura per una seconda lunghezza d'onda λ2, registrando nuovamente il ritardo temporale τ2 al quale l'SRS(λ2) era massimo.
      NOTA: Poiché il GDD è definito come la derivata del ritardo del gruppo rispetto alla frequenza angolare, le suddette misurazioni consentono la stima del GDD del fascio a banda larga (Eq [1]).
      Equation 1(1)
  7. Utilizzando una piastra d'onda λ/2, impostare la polarizzazione del fascio della pompa a 45°. Guidare la pompa polarizzata su una piastra YVO4 con una lunghezza di 13,3 mm, impostando l'asse veloce di questo cristallo birifrangente verticale.
    NOTA: Viaggiando attraverso la piastra YVO4 , gli impulsi della pompa saranno divisi in due repliche polarizzate ortogonalmente che si propagano in modo collineare ma mantenendo un ritardo Δt ≈ 10 ps tra di loro. Questo ritardo è una funzione dello spessore e degli indici di rifrazione del cristallo birifrangente. Di seguito, le repliche della pompa con lo stesso stato di polarizzazione degli impulsi di Stokes saranno chiamate "segnale" mentre quelle con uno stato ortogonale come "riferimento". I dettagli di questa tecnica, chiamata rilevamento bilanciato in linea, sono stati descritti in precedenza30.
  8. Combina la pompa e i raggi Stokes con uno specchio dicroico e allineali con cura usando un paio di fori stenopeici fluorescenti, assicurandoti che entrambi si propaghino in modo collinoso. Attenuare i fasci e utilizzare un obiettivo per focalizzarli su un fotodiodo veloce (almeno 100 MHz di larghezza di banda).
    1. Blocca la pompa e misura i singoli impulsi stokes con un oscilloscopio digitale ad alta larghezza di banda. Utilizzare il segnale di trigger del laser come sorgente di clock per le misurazioni dell'oscilloscopio. Determinare il valore medio al quale la tensione del fotodiodo raggiunge il suo massimo.
    2. Bloccare il raggio di Stokes e ripetere questa procedura per gli impulsi della pompa. Aumentare o ridurre il percorso ottico del fascio della pompa (Stokes) fino a quando i suoi impulsi arrivano all'incirca nello stesso momento degli impulsi stokes (pompa).
      NOTA: Questo dovrebbe garantire una precisione di pochi millimetri al massimo nella corrispondenza della differenza di percorso ottico tra i due bracci.
    3. Rimuovere il fotodiodo e posizionare un cristallo non lineare con un angolo di taglio adatto per la generazione di somma-frequenza (SFG) tra i fotoni della pompa-Stokes.
      NOTA: Il cristallo non lineare utilizzato qui è stato tagliato per la corrispondenza di fase di tipo I, θ = 90 °, φ = 9,8 °. L'asse ottico del cristallo non lineare dovrebbe essere parallelo alla polarizzazione degli impulsi di Stokes e del segnale.
    4. Rendere i fasci pompa/Stokes leggermente non collegiali e spostare la linea di ritardo fino all'SFG, un segnale che, a causa della corrispondenza di fase, si trova tra gli SHG della pompa e i fasci di Stokes. Se il segnale non viene trovato, verificare la sovrapposizione spaziale dei due fasci sul cristallo.
      NOTA: l'SFG è spostato in blu e deve essere facilmente visibile ad occhio nudo.
    5. In caso di difficoltà impreviste, posizionare un filtro passa-basso per rimuovere la pompa e Stokes e i rispettivi SHG e misurare l'SFG con uno spettrometro (Figura 7A). Trova il ritardo temporale al quale l'SFG raggiunge la sua massima intensità, un valore che determina la sovrapposizione spazio-temporale ideale richiesta per la generazione di segnali non lineari e fissa la linea di ritardo lì (Figura 7B).
  9. Misurare i profili del fascio con una telecamera calibrata. In alternativa, utilizzare una scheda a infrarossi e stimare i diametri a occhio. Utilizzare due telescopi, uno per la pompa e un altro per il fascio di Stokes. Con questi telescopi, cerca di abbinare i diametri del fascio all'apertura posteriore dell'obiettivo di eccitazione.
    NOTA: questa procedura garantirà la massima risoluzione spaziale del setup.
    1. Una volta ottenuto il segnale SRS, utilizzare il telescopio sul fascio della pompa per modificarne il diametro, variandone la gamma di Rayleigh e, di conseguenza, il volume di interazione al fuoco del microscopio. Fermarsi quando viene raggiunto il massimo SRS.
  10. Utilizzare un fotodiodo per misurare l'intensità del fascio della pompa (Stokes) e, con la responsività del fotodiodo, calcolare la potenza Equation 2 media che incide sull'area attiva del rivelatore.
    1. Se si utilizza un fotodiodo ad alta larghezza di banda, collegare un filtro passa-basso elettronico per ottenere solo il componente costante o CC. Per misurare δP(f), collegare l'uscita di un fotodiodo ad alta larghezza di banda (scollegare il filtro passa-basso) all'ingresso di un amplificatore lock-in. Memorizza l'uscita Equation 3 lock-in a diverse frequenze di demodulazione e usa la responsività del fotodiodo per convertire da V a W.
      NOTA: gli amplificatori lock-in commerciali sono dotati di strumenti integrati per misurare δP(f) (ad esempio, Zurich Instruments incorporata in LabOne a Frequency Sweeper31).
    2. Dopo aver misurato il RIN dei fasci, spegnere il laser e misurare il rumore elettronico (cioè il RIN calcolato senza alcuna luce sui rilevatori).
      NOTA: A condizione che il RIN sia limitato dalle fluttuazioni del laser e non dal rumore di tiro, questa misurazione scura aiuterà a diagnosticare la strumentazione utilizzata per le misurazioni; se il rumore elettronico è alto quanto il RIN del laser, questo non può essere utilizzato per misurare il RIN del laser; potrebbe essere necessario utilizzare amplificatori a rumore ultrabasso per ridurre il rumore elettronico.
    3. Se il RIN è limitato dal rumore di tiro e non dalla fluttuazione del laser, far brillare più potenza ottica sul rilevatore. Vedere la Figura 8.

3. Impostazione del rilevamento spettrale per l'imaging SRS

  1. Guidare la pompa e i fasci di Stokes al microscopio.
  2. Posizionare il campione discusso nella sezione 1 e trovare una regione senza perline per aiutare ad allineare il raggio della pompa. Utilizzando una telecamera, misurare il profilo riflesso del fascio Stokes (pompa) mentre si blocca la pompa (Stokes). Regolare le posizioni dei punti laser con gli specchi subito prima del microscopio.
    NOTA: per ottenere la più alta generazione di SRS, dovrebbero sovrapporsi perfettamente. La figura 9 mostra (A) la pompa, (B) Stokes e (C) entrambi i fasci perfettamente sovrapposti al piano focale del microscopio.
  3. Rendi confocali gli obiettivi di eccitazione e raccolta.
    NOTA: l'uso di obiettivi corretti all'infinito significa che focalizzare la pompa sul piano del campione si tradurrà in un raggio collimato all'apertura posteriore dell'obiettivo di raccolta.
    1. Mettere un filtro a passo corto per rimuovere lo Stokes modulato e guidare il raggio della pompa verso la griglia. Posizionare una lente dopo la griglia per focalizzare il raggio disperso sui rilevatori.
      NOTA: L'equazione del reticolo aiuterà a determinare la dispersione lineare (cioè, quanti nm per mm sul piano del rivelatore con una lente di una data lunghezza focale f32). L'equazione del reticolo mette in relazione la periodicità del solco d del reticolo, l'angolo di incidenza α, l'angolo di diffrazione β, la lunghezza d'onda diffratta λ e l'ordine di diffrazione m (Eq [2]).
      Equation 4 (2)
  4. Per un rilevamento bilanciato, misurare lo spettro del riferimento e le repliche del segnale che si propagano lungo il fascio della pompa.
    NOTA: Il profilo spaziale del fascio della pompa dopo la griglia è una linea che comprende i diversi componenti spettrali della pompa a banda larga lungo la sua lunghezza. Ogni componente spettrale della linea della pompa sarà focalizzato a distanza f da una lente sferica (vedere i passaggi 3.1-3.2).
    1. Per evitare di tagliare la pompa dispersa, posizionare la lente sferica il più vicino possibile alla griglia. Metti un PBS subito dopo la lente sferica per separare le repliche della pompa.
      NOTA: Qui, è stato utilizzato uno splitter a fascio cubo polarizzante perché questo tipo di polarizzatore non rimescola la polarizzazione del fascio della pompa. Inoltre, separa efficacemente le diverse repliche della pompa e può essere abbastanza grande da evitare di tagliare la pompa a banda larga. Il PBS rifletterà la replica del segnale (s-polarizzata) e trasmetterà la replica di riferimento (p-polarizzata).
    2. Con una coppia di specchietti retrovisori, guidare il segnale e fare riferimento ai rispettivi rilevatori (Figura 1).
      NOTA: nella configurazione bilanciata ideale, le repliche di segnale e riferimento devono avere la stessa potenza ottica.
    3. Per rimuovere il rumore nel fascio della pompa, correlare i canali dell'array di fotodiodi che misurano il segnale con le loro controparti nel rilevatore di riferimento. Quindi, assicurarsi che l'nesimo fotodiodo del segnale e gli array di fotodiodi di riferimento misurino la potenza ottica della stessa componente spettrale del segnale e delle repliche di riferimento.
      NOTA: la Figura 8 mostra spettri RIN esemplari.
  5. Per garantire la corrispondenza spettrale tra i due array di fotodiodi, posizionare una piccola fessura o un diaframma tra la griglia e il PBS per filtrare spazialmente la pompa dispersa. Clip tutti i componenti spettrali tranne uno delle repliche della pompa per centrare i raggi trasmessi sull'n° rivelatore degli array di fotodiodi di riferimento e di segnale. Utilizzare gli specchietti retrovisori dello sterzo menzionati per regolare la correlazione dei diversi canali di rilevamento.
  6. A questo punto, avviare la microscopia SRS. Per fare ciò, modulare lo Stokes, la scansione raster del campione e acquisire il trasferimento di modulazione sullo spettro della pompa (ΔI) con il corrispondente spettro DC (I) per ottenere lo spettro SRS normalizzato (ΔI / I) da ciascun pixel. Produrre matrici tridimensionali le cui righe (x) e colonne (y) contengono le posizioni scansionate del campione. Su ogni vettore (z) ortogonale al piano x-y, memorizzare uno spettro SRS.
    NOTA: la Figura 12 mostra la struttura dei dati iperspettrali SRS.
    1. Impostare la potenza del fascio di Stokes a 65 mW e quella del fascio della pompa a banda larga a 20 mW. Imposta un tempo di integrazione ideale per gli esperimenti.
      NOTA: Qui, il tempo di integrazione è stato di 44 μs; tuttavia, il tempo di permanenza dei pixel era di 1 ms a causa dello scanner piezoelettrico lento.

4. Chemiometria dei dati SRS iperspettrali

  1. Utilizzare l'analisi della risoluzione della curva multivariata per districare i diversi costituenti chimici del campione. Scarica la GUI dal link in Tauler, de Juan e Jaumot33.
    NOTA: Qui, il programma MATLAB MCR-ALS (Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares) sviluppato da Tauler e colleghi è stato utilizzato 34,35. Per le applicazioni di MCR-ALS ai dati SRS, fare riferimento a 36,37; per discussioni dettagliate sull'algoritmo, fare riferimento a 38.
  2. In MATLAB, rimodella il cubo di dati iperspettrali SRS in una matrice D con le relative righe contenenti gli spettri SRS. Supponiamo che l'ipercubo SRL spiegato D sia una combinazione lineare della concentrazione C e dei profili spettrali S dei costituenti chimici del campione (cioè D = CS T + E, dove E è una matrice che contiene l'errore sperimentale e l'apice T indica la trasposizione della matrice).
  3. Ottenere i componenti principali dei dati per separare C e S. Come è noto a priori che il campione discusso nella sezione 1 contiene quattro specie, vale a dire DMSO, olio d'oliva, PMMA e PS, configurare il programma per cercare quattro specie più un'altra per tenere conto del rumore di fondo. Se c'è un campione diverso con un numero maggiore o inferiore di specie, configurare il programma di conseguenza.
    NOTA: Il programma effettua una decomposizione a valore singolare dei dati spettrali, utilizzandoli come ipotesi iniziali degli spettri puri S.
    1. In alternativa, alimentare il programma con una matrice contenente le tracce spettrali conosciute (ad esempio, gli spettri Raman spontanei delle sostanze).
      NOTA: Utilizzando le stime iniziali degli spettri puri, il programma calcolerà C = DS(STS)−1 e ST = (CTC)−1CTD. I nuovi valori di C e S sono ottimizzati con un algoritmo alternato dei minimi quadrati.
  4. Poiché SRS è un segnale non negativo, vincolare l'algoritmo dei minimi quadrati alternati per fornire solo valori positivi.
    NOTA: Il C e S ottimizzati permetteranno di costruire una nuova matrice D*= CST, un set di dati che il programma confronterà con i dati originali D. Il programma esegue automaticamente l'iterazione di questi passaggi fino a quando la differenza tra D* e D non è inferiore a un valore di soglia arbitrario che può essere definito.
  5. Traccia C e S per acquisire immagini chimiche e spettri caratteristici dei costituenti chimici del campione.

Representative Results

La Figura 3 mostra risultati esemplari ottenuti utilizzando questo protocollo con PS, PMMA e olio d'oliva. Questa rotazione di LBO1 cambierà l'indice di rifrazione sperimentato dal campo SHG, modificandone direttamente la velocità di fase. Quando la velocità di fase del campo SHG corrisponde a quella della polarizzazione non lineare indotta in LBO1, il campo generato non linearmente e la polarizzazione non lineare saranno in fase, portando a un'intensa radiazione SHG. In altre parole, la modifica dell'angolo di φ di LBO1 consentirà all'utente di raggiungere la condizione di corrispondenza di fase ideale per SHG. Poiché qui viene utilizzato un cristallo di corrispondenza di fase di tipo I, la polarizzazione del fascio SHG sarà ortogonale a quella del fascio fondamentale (Figura 5B).

La Figura 8 mostra il RIN delle sorgenti ottiche utilizzate in questo protocollo e il limite shot-noise, che è una conseguenza della natura quantistica di elettroni e fotoni che pone un limite fondamentale al rumore laser. Il RIN limitato shot-noise viene calcolato con Equation 5 come mostrato da Eq (3).

Equation 6 (3)

Dove h è la costante di Planck e ν è la frequenza ottica. Pertanto, il rumore di tiro fornisce linee guida utili per la progettazione elettronica.

La Figura 11A e la Figura 11C mostrano dati esemplari di spettri bilanciati e sbilanciati. Naturalmente, gli effetti del rilevamento bilanciato influiscono sui risultati finali degli esperimenti, vale a dire le mappe chimiche. La Figura 11B e la Figura 11D mostrano immagini composite rispettivamente nelle condizioni sbilanciate e bilanciate. Implementare con successo il protocollo descritto aiuterà a identificare e localizzare i diversi costituenti chimici di un campione eterogeneo ed estrarre i loro spettri SRS caratteristici. Sottoponendo i dati iperspettrali della Figura 12 all'analisi chemiometrica si ottiene la Figura 13. La Figura 13A mostra un composito delle mappe di concentrazione dei diversi costituenti chimici del campione, mentre la Figura 13B mostra i loro spettri SRS caratteristici. Si noti che i dati mostrati nella Figura 13A non solo consentono all'utente di identificare facilmente i diversi componenti del campione, ma anche di eseguire analisi più quantitative. Ad esempio, utilizzando le mappe di concentrazione, potremmo calcolare la media della concentrazione frazionaria di ciascuna specie chimica: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS e 22% olio d'oliva.

Figure 1
Figura 1: Schema del microscopio SRS a banda larga utilizzato in questo protocollo. Abbreviazioni: PBSx = beamsplitter polarizzante; SHG = modulo di seconda generazione armonica; OPO = oscillatore parametrico ottico; AOM = modulatore ottico acousto; SPF = filtro a passaggio corto; M-LIA: Amplificatore lock-in multicanale; DM = specchio dicroico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Spettri della pompa a banda larga sintonizzabile (blu) e delle travi Stokes a banda stretta (rossa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immagine a campo luminoso del campione chimicamente eterogeneo. Si noti che la microscopia convenzionale non consente di distinguere i diversi costituenti. Barra della scala = 100 μm. Abbreviazioni: PS = polistirolo; PMMA = polimetilmetacrilato; DMSO = dimetilsolfossido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Modulazione degli impulsi di Stokes a banda stretta. (A) La traccia blu trasparente mostra lo 0° fascio diffratto, mentre quello nero mostra il corrispondente 1° ordine. (B) Configurazione ottica per ottimizzare l'efficienza di modulazione del fascio diffratto di 1° ordine e messa a punto della dimensione dello spot del fascio di Stokes prima di arrivare all'obiettivo di eccitazione. Abbreviazioni: AOM = modulatore ottico acousto; fx = lunghezza focale dell'obiettivo X. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Processi ottici non lineari necessari per guidare l'OPO. (A) Geometria dell'interazione SHG. Due fotoni fondamentali a ω1 portano il sistema materiale a un livello virtuale ad alta energia, da dove il sistema materiale salta verso il basso allo stato fondamentale, emettendo un fotone a ωSHG. (B) Schema dell'esperimento SHG. (C) Uno schema delle configurazioni SHG e OPO. (D) Geometria dell'interazione DFG. Unfotone SHG ω è diviso in fotoni di segnale (segnale ω) e folle (ωIdler). Un guadagno del fascio di segnale si ottiene alimentando i fotoni del segnale e facendoli risuonare nella cavità. (E) Schema dell'esperimento DFG. Abbreviazioni: SMx = specchio sferico (R = 75 mm); OPO = oscillatore parametrico ottico; SHG = modulo di seconda generazione armonica; DFG = generazione differenza-frequenza; LBO = triborato di litio; OC = condensatore d'olio; DM = specchio dicroico; fx = lunghezza focale dell'obiettivo X. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Geometria del compressore prismatico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Generazione di frequenza somma per ottimizzare la sovrapposizione spazio-temporale. (A) SFG tra la pompa e Stokes e i rispettivi SHG che impattano su uno schermo. Qui, una lente ha focalizzato la pompa e i raggi Stokes sul cristallo, mentre un filtro passa-basso li ha rimossi. (B) Intensità dell'SFG tra pompa e Stokes in funzione del ritardo temporale. Impostate il tempo zero della configurazione SRS nella posizione che massimizza l'SFG. L'asimmetria della correlazione incrociata in B è dovuta al profilo temporale causato dall'etalon sul fascio di Stokes. Abbreviazioni: SFG = generazione somma-frequenza; SHG = modulo di seconda generazione armonica; SRS = spettroscopia di scattering Raman stimolata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Spettri RIN. La banda evidenziata in verde mostra la migliore regione spettrale per gli esperimenti SRS. La modulazione del fascio stokes a qualsiasi frequenza all'interno di questa banda garantisce che gli effetti del rumore laser sul segnale SRS saranno i più bassi possibili. Abbreviazioni: RIN = rumore di intensità relativa; SRS = spettroscopia di scattering Raman stimolata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Profili del fascio. (A) Pompa, (B) Stokes e (C) pompa e Stokes. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: Geometria presunta per un reticolo a dispersione e un rivelatore a matrice di fotodiodi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11. Gli effetti del rilevamento bilanciato. Effetti su spettri (A, C) e immagini chimiche (B, D). I compositi mostrati nei pannelli (B) e (D) sono i risultati finali degli esperimenti (cioè dopo l'analisi chemiometrica dei dati iperspettrali. Vedere la sezione 4 del protocollo per i dettagli). Barre della scala = 10 μm. Abbreviazione: SRS = spettroscopia di scattering Raman stimolata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 12
Figura 12: Un ipercubo SRS rappresentativo acquisito con microscopia SRS a banda larga. Il piano x-y memorizza le coordinate delle posizioni scansionate, mentre ogni vettore lungo z registra uno spettro SRS. Abbreviazione: SRS = spettroscopia di scattering Raman stimolata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 13
Figura 13: Analisi chemiometrica dei dati SRS iperspettrali. (A) Composito delle mappe di concentrazione dei diversi costituenti del campione. B) Spettri caratteristici delle specie chimiche. In entrambi i pannelli, giallo: olio d'oliva, blu: DMSO, ciano: PS e arancione: PMMA. Barra della scala = 20 μm (A). Abbreviazioni: SRS = spettroscopia di scattering Raman stimolata; PS = polistirolo; PMMA = polimetilmetacrilato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La microscopia SRS a banda larga è una potente tecnica di imaging che offre un contrasto chimico autentico per identificare e districare i costituenti chimici di un campione eterogeneo. Il potenziale di questo strumento analitico può essere utile per diversi campi di ricerca, che vanno dalla scienza dei materiali all'istopatologia. Lo svantaggio della microscopia SRS a banda larga è il fatto che è tecnicamente impegnativa; lo sperimentatore non solo richiede know-how sulle sorgenti laser a banda larga, ma ha anche bisogno di manipolare gli impulsi laser per generare in modo efficiente SRS, un segnale che, a sua volta, deve essere misurato con sofisticati schemi di rilevamento. Questo documento presenta un protocollo che descrive un flusso di lavoro per produrre mappe chimiche di composti chimici misti utilizzando un microscopio SRS a banda larga multiplex. Sebbene il lavoro descritto possa essere banale per alcuni fisici laser e microscopisti non lineari, potrebbe non essere il caso per i lettori interessati ai benefici della microscopia SRS a banda larga la cui conoscenza scientifica risiede al di fuori di questi domini. Pertanto, abbiamo mirato a dettagliare ogni passo per guidare il vasto pubblico interessato alla microscopia SRS a banda larga.

Il protocollo in questione è iniziato mostrando come preparare un campione semplice ma spettroscopicamente ricco composto da diversi scatterer Raman forti e ben noti. Abbiamo discusso su come ottenere la pompa a banda larga e i fasci Stokes a banda stretta necessari per impostare un microscopio SRS. La Figura 5C mostra uno schema delle configurazioni SHG e OPO. Si noti che l'obiettivo f1 focalizza il fascio fondamentale su LBO1 per generare l'SHG, mentre uno specchio dicroico riflette la radiazione SHG e trasmette il fascio fondamentale residuo. Una seconda lente f2 collima il fascio SHG. Poiché f2 > f1, il fascio SHG viene espanso di un fattore pari a f2/f1. Un terzo obiettivo f3 focalizza il fascio SHG espanso su un secondo cristallo LBO di tipo I (LBO2) tagliato a θ = 90° e φ = 29,0°. Pompando LBO2 con il già citato SGH (520 nm), la radiazione all'interno dell'intervallo 680-910 nm emergerà da LBO2 attraverso la generazione di differenza-frequenza (DFG), producendo due fasci: il segnale e il folle27 (Figura 5D,E). Quest'ultimo viene scartato mentre il primo viene amplificato nella cavità OPO per erogare gli impulsi della pompa impiegati negli esperimenti SRS. La pompa dell'OPO a 520 nm, vale a dire il fascio SHG, non deve essere confusa con la pompa degli esperimenti SRS (cioè il fascio di segnale dell'OPO).

Il contrasto nella microscopia SRS ha origine da un segnale non lineare generato nel punto focale del microscopio, un segnale che richiede di confinare un gran numero di fotoni nel piano del campione in un dato momento. Questo confinamento fotonico è ottenuto con un obiettivo al microscopio ad alta apertura numerica (NA), una serie di lenti che imposta anche la risoluzione spaziale del sistema: maggiore è il NA, maggiore è la risoluzione spaziale. Tuttavia, gli obiettivi NA elevati sono densamente pieni di vetro, che introduce GDD positivo alla radiazione pulsata, un cinguettio di frequenza che alla fine amplia il profilo temporale degli impulsi39. Pertanto, il GDD introdotto dall'obiettivo del microscopio potrebbe aumentare la durata degli impulsi della pompa a banda larga, rendendolo ancora più lungo dell'inviluppo temporale di Stokes e riducendo la larghezza di banda effettiva e accessibile del segnale Raman. Inoltre, questo ampliamento potrebbe anche introdurre una distorsione del profilo spettrale dello spettro SRS misurato.

In CARS, il segnale spettroscopicamente rilevante emerge a lunghezze d'onda diverse da quelle dei campi di eccitazione. Un semplice tubo fotomoltiplicatore o una telecamera CCD (Charge-Coupled Device) può essere utilizzata per integrare il segnale CARS nel tempo, sommando migliaia di impulsi per calcolare la media del rumore laser. Invece, il segnale SRS appare come un debole trasferimento di modulazione incorporato all'interno di uno sfondo laser forte e fluttuante. Poiché questa modulazione è debole, il rumore laser può facilmente sopraffarlo, riducendo sia la velocità di imaging che la sensibilità del microscopio SRS. Pertanto, prima dell'imaging, è imperativo misurare il rumore di intensità relativa (RIN) per determinare se il laser è adatto per l'imaging SRS ad alta velocità e selezionare la frequenza di modulazione con il rumore più basso. Il RIN è definito come la densità spettrale della potenza di rumore [δP(f), con unità W2/Hz] del laser normalizzata dalla potenza ottica media (Equation 2)40,41. In altre parole, il RIN descrive le fluttuazioni laser normalizzate a diverse frequenze (Eq [4]).

Equation 7 (4)

Pertanto, il RIN è un parametro del sistema SRS che determina la gamma di frequenza di modulazione ideale per gli esperimenti. Ad esempio, la barra dell'olivo nella Figura 8 mostra la gamma di frequenza di modulazione ideale per l'imaging SRS. Nel caso di SRS a banda stretta, l'utente deve misurare il RIN sia della pompa che di Stokes per scegliere quale fascio deve essere modulato per ottenere prestazioni ottimali. Si noti dalla Figura 8, ad esempio, che il fascio di Stokes ha un RIN leggermente superiore rispetto alla pompa, il che implica che le misurazioni della SSR risulterebbero più rumorose delle loro controparti SRL. Nel caso di SRS a banda larga, il fascio che dovrebbe essere modulato è il fascio a banda stretta.

La dispersione angolare D del reticolo esprime l'angolo di diffrazione in funzione della lunghezza d'onda, ed è definita come la derivata dell'equazione del reticolo. Per la configurazione di Littrow, la dispersione angolare è data da Eq (5).

Equation 8 (5)

Per ottenere Eq (5), abbiamo assunto α = β, risolto Eq (2) per m/d e inserito il risultato in dβ/ dλ. Si noti che nella configurazione di Littrow, β = sin-1(mλ/2d). All'interno dell'approssimazione a piccolo angolo, il cambiamento di posizione lungo lo spettro è fdβ ≈ dl (Figura 10). Quindi, inserendo dβ in Eq (5), possiamo calcolare la dispersione lineare, una quantità con unità di nm mm-1 usando Eq (6):

Equation 9 (6)

Per un reticolo di diffrazione operante nella configurazione Littrow con 1.851,85 scanalature/mm, d = 540 nm. Se usiamo la diffrazione della luce del primo ordine a ~789 nm, D = 0,0027 rad nm-1. Con un obiettivo f = 750 mm, otteniamo una dispersione lineare di ≈ 0,5 nm mm-1, che si traduce in ≈ 7,8 cm-1 mm-1. Pertanto, la lunghezza focale della lente determina la "densità" di nm per mm sul piano del rivelatore: più lunga è la lunghezza focale, minore è il nm per mm ottenuto, aumentando lo spazio tra le linee spettrali della pompa a banda larga. Al contrario, con lunghezze focali più corte, ci saranno più nm per mm sul piano del rivelatore, riducendo lo spazio occupato dalla pompa dispersa.

Il rilevamento bilanciato migliora la qualità dell'immagine e la sensibilità delle configurazioni rumorose. Ad esempio, secondo gli spettri RIN mostrati nella Figura 8 e considerando il tipico SRS con un'ampiezza di 1 x 10-5, il rapporto segnale-rumore sbilanciato (SNR) è ≈60. Utilizzando il rilevamento bilanciato (cioè vicino al rumore di tiro), è possibile ottenere un SNR di ≈145. La Figura 11 mostra spettri e immagini composite in condizioni bilanciate e sbilanciate. Naturalmente, gli effetti del rilevamento bilanciato influiscono sui risultati finali degli esperimenti, vale a dire le mappe chimiche. Supportati da questi risultati, sottolineiamo che il rilevamento bilanciato è una tecnica potente per contrastare gli effetti dannosi delle fluttuazioni laser sulla qualità dell'immagine. Vale la pena ricordare che il rilevamento bilanciato è più adatto per i laser rumorosi, come gli oscillatori a fibra. I microscopi SRS che funzionano con sorgenti luminose ottiche silenziose (ad esempio, laser a stato solido) potrebbero non richiedere un rilevamento bilanciato.

Il protocollo spiega anche un approccio basato su ottiche non lineari per trovare la sovrapposizione spazio-temporale tra gli impulsi di questi fasci. Abbiamo descritto i vantaggi dell'utilizzo del 1° invece dello 0° ordine di diffrazione di un AOM come fascio di Stokes modulato. Inoltre, gli effetti dannosi della dispersione sull'efficienza di generazione SRS sono stati descritti con suggerimenti di modi per mitigarli tramite un compressore prismatico. Inoltre, il protocollo spiega come allineare i prismi ed evidenzia tre aspetti critici da considerare per prestazioni ottimali. Non solo discutiamo la rilevanza del RIN per la microscopia SRS, ma mostriamo anche come misurarlo con un amplificatore lock-in e, con lo spettro RIN, definire la migliore frequenza di modulazione. Con un esempio concreto, questo documento spiega come l'equazione del reticolo aiuta a progettare la catena di rilevamento. Infine, il protocollo illustra, con dati SRS reali, la struttura dell'ipercubo SRS e come analizzarlo con un linguaggio di programmazione scientifica convenzionalmente utilizzato.

Questo protocollo ha tre limitazioni minori. In primo luogo, lo schema di rilevamento impiegato in questo contributo consiste in un rilevatore lock-in multicanale non convenzionale progettato e costruito internamente da Sciortino et al.26 Come dimostrato in precedenza25, questo rilevatore può essere sostituito da un fotodiodo bilanciato pronto all'uso. Sebbene questa modifica riguardi solo il rivelatore e lasci il protocollo praticamente invariato, con un singolo fotodiodo, è necessario scansionare ogni componente spettrale sul rivelatore invece di misurarli tutti in una volta. In secondo luogo, questo protocollo utilizza il rilevamento bilanciato in linea, che richiede l'inserimento di diversi elementi ottici nel percorso del fascio. Questi elementi ottici aumentano la complessità del sistema e portano a perdite di potenza ottica e allargamento degli impulsi.

Il rilevamento bilanciato in linea richiede anche che le due repliche della pompa passino attraverso il campione, una situazione che potrebbe non essere ideale per i campioni sensibili alla luce, come le cellule viventi, o per quelli fortemente birifrangenti in cui le due repliche della pompa possono sperimentare proprietà ottiche diverse, annullando così il rilevamento bilanciato. In terzo luogo, il protocollo si basa su un OPO costruito in casa, un dispositivo che potrebbe non essere prontamente disponibile. Tuttavia, le alternative agli spettri a banda larga forniti dall'OPO sono i supercontinendi da fibre ottiche non lineari o cristalli sfusi. Quest'ultimo potrebbe essere impiegato solo con laser a bassa frequenza di ripetizione (fino a 5 MHz). Pertanto, come per ogni progetto sperimentale, il protocollo a portata di mano ha alcune limitazioni. Tuttavia, sono minimi e non compromettono il successo di questo approccio.

Sebbene qui sia descritto un campione di riferimento, questo protocollo può districare con successo specie chimiche all'interno di cellule e tessuti animali e vegetali, come cellulosa, specie lipidiche o proteine, trovando applicazioni pratiche in diverse missioni biochimiche o come strumento diagnostico in istopatologia. Allo stesso modo, questo protocollo può essere uno strumento prezioso nelle scienze dei materiali. Ad esempio, seguendo questo protocollo, si può interrogare la composizione molecolare e la concentrazione delle specie polimeriche42. Inoltre, questa metodologia è compatibile con altre tecniche di microscopia non lineare, come la microscopia a banda larga basata su pompa-sonda43 e l'eterodina CARS44, processi di miscelazione a quattro onde che, come con SRS, richiedono anche due fasci di luce di eccitazione e misure di trasferimento di modulazione. Infine, alcune delle informazioni contenute in questo documento possono essere applicate a tecniche di imaging non lineare che non si basano su tecniche di trasferimento di modulazione, ma richiedono l'allineamento di due o più raggi laser pulsati, come le microscopie convenzionali CARS45 e SFG46.

In sintesi, questo protocollo descrive una potente metodologia basata sulla microscopia SRS a banda larga per estrarre mappe chimiche e i loro spettri SRS caratteristici da miscele chimicamente eterogenee, fornendo set di dati che consentono un'analisi quantitativa dei dati semplice. La versatilità e la semplicità del metodo danno anche al lettore interessato la possibilità di adattarlo a diverse tecniche non lineari.

Disclosures

G. C. dichiara il coinvolgimento con la società Cambridge Raman Imaging, che mira a commercializzare la tecnologia di microscopia SRS a banda larga. Gli altri autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

D. P. riconosce il finanziamento del progetto dell'Unione Europea CRIMSON nell'ambito della Convenzione di Sovvenzione n. 101016923 e del progetto della Regione Lombardia NEWMED nell'ambito della Convenzione di Sovvenzione n. POR FESR 2014-2020. G. C. riconosce il finanziamento del progetto dell'Unione Europea GRAPHENE Core3 nell'ambito della convenzione di sovvenzione numero 881603. G. C. riconosce anche il finanziamento della King Abdullah University of Science and Technology, grant award number: OSR-2016-CRG5-3017-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection objective Nikon CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon Oil immersion objective
Coverslips Thermo Fisher 043211-KJ Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line Physik Instrumente (PI) M-406.6PD Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO Merck D8418-500ML Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon SLS Optics Ltd Custom made Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective Nikon CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon Water immersion objective
Grating LightSmyth T-1850-800s Series High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser Coherent Custom made Fidelity, HP
λ/2 Thorlabs SAHWP05M-1700 Mounted superachromatic half-wave plate
PBS Thorlabs CM5-PBS203/M 16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads Merck MFCD00198073 Micro particles based on polymethacrylate
Prisms Crisel 320-8218 LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads Merck 72986-10ML-F Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal Dr. Sztatecsny GmbH Custom made  thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 - 1,100 nm

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Engineering Raman scattering stimolazione Raman scattering microscopia non lineare iperspettrale banda larga imaging vibrazionale
Imaging chimico multiplex basato sulla microscopia a dispersione Raman stimolata a banda larga
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De la Cadena, A., Vernuccio, F., Talone, B., Bresci, A., Ceconello, C., Das, S., Vanna, R., Cerullo, G., Polli, D. Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63709, doi:10.3791/63709 (2022).

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