تقسيم العظام الصدغية البشرية عالي السرعة لتقييم أمراض الأذن الوسطى المرتبطة ب COVID-19
Summary
تصف هذه المقالة تقنية لتقسيم العظام الصدغية البشرية السريعة التي تستخدم منشارا دقيقا مع شفرات الماس المزدوجة لتوليد شرائح رقيقة لإزالة الكلس السريع وتحليل الكيمياء المناعية للعظام الصدغية.
Abstract
يعد التحليل النسيجي المرضي لأقسام العظام الصدغية البشرية تقنية أساسية لدراسة أمراض الأذن الداخلية والوسطى. يتم تحضير أقسام العظام الصدغية عن طريق حصاد العظام الصدغي بعد الوفاة ، والتثبيت ، وإزالة الكلس ، والتضمين ، والتلطيخ. نظرا لكثافة العظم الصدغي ، فإن إزالة الكلس هي عملية تستغرق وقتا طويلا وكثيفة الاستخدام للموارد. قد يستغرق إعداد الأنسجة الكامل 9-10 أشهر في المتوسط. هذا يبطئ أبحاث أمراض الأذن ويعيق الدراسات الحساسة للوقت ، مثل تلك المتعلقة بجائحة COVID-19. تصف هذه الورقة تقنية للتحضير السريع وإزالة الكلس من أقسام العظام الصدغية لتسريع معالجة الأنسجة.
تم حصاد العظام الصدغية بعد الوفاة باستخدام التقنيات القياسية وتثبيتها في الفورمالين بنسبة 10٪. تم استخدام منشار دقيق مع شفرات الماس المزدوجة لقطع كل قسم إلى ثلاثة أقسام سميكة. ثم تم إزالة الكلس من أقسام العظام الصدغية السميكة في محلول إزالة الكلس لمدة 7-10 أيام قبل أن يتم تضمينها في البارافين ، وتقسيمها إلى أقسام رقيقة (10 ميكرومتر) باستخدام التبريد ، وتركيبها على شرائح غير مشحونة. ثم تم إزالة عينات الأنسجة وإعادة ترطيبها لتلطيخ الأجسام المضادة (ACE2 و TMPRSS2 و Furin) وتصويرها. خفضت هذه التقنية الوقت من الحصاد إلى تحليل الأنسجة من 9-10 أشهر إلى 10-14 يوما. قد يزيد تقسيم العظام الصدغي عالي السرعة من سرعة أبحاث أمراض الأذن ويقلل من الموارد اللازمة لإعداد الأنسجة ، مع تسهيل الدراسات الحساسة للوقت مثل تلك المتعلقة ب COVID-19.
Introduction
توفر أبحاث العظام الصدغية البشرية موردا لا يقدر بثمن لدراسة علم الأمراض والفيزيولوجيا المرضية للأذن الداخلية والوسطى. قبل القرن التاسع عشر ، لم يكن يعرف سوى القليل عن مرض الأذن1،2،3. لفهم مرض الأذن بشكل أفضل و “إنقاذ الجراحة السمعية من أيدي الدجالين” ، طور جوزيف توينبي (1815-1866) طرقا لدراسة الأقسام النسيجية للعظم الصدغي البشري3. تم تعزيز هذا العمل من قبل آدم بوليتزر (1835-1920) في فيينا وغيرها في جميع أنحاء أوروبا خلال الفترة المتبقية من القرن التاسع عشر ، الذي استخدم أقسام العظام الصدغية لوصف الأنسجة المرضية للعديد من الحالات الشائعة التي تؤثر على الأذن2،3،4.
تم افتتاح أول مختبر للعظام الصدغية البشرية في الولايات المتحدة في عام 1927 في مستشفى جونز هوبكنز ، حيث طورت نقابة ستايسي (1890-1966) طرقا لتقسيم العظام الصدغية 5,6. تألفت الطرق التي طورتها النقابة من عملية مدتها 9-10 أشهر شملت حصاد ما بعد الوفاة ، والتثبيت ، وإزالة الكلس في حمض النيتريك ، والجفاف في الإيثانول ، وتضمين السيلويدين ، والتقسيم ، والتلطيخ ، والتركيب. تم إجراء تعديلات على هذه التقنية في وقت لاحق من قبل هارولد شوكنخت (1917-1996)7. ومع ذلك، فإن المكونات الأساسية لهذه العملية لا تزال دون تغيير جوهري.
شكلت الموارد الكبيرة اللازمة للحفاظ على مختبر العظام الصدغي تحديا لأبحاث العظام الصدغية ومن المحتمل أن تسهم في انخفاض شعبيتها على مدى السنوات ال 30 الماضية 4,8. يجب تخصيص جزء كبير من موارد مختبر العظام الصدغي لعملية إعداد العظام الصدغية لمدة 9-10 أشهر. واحدة من أكثر الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا في التحضير هي إزالة الكلس من العظم الصدغي ، وهو أكثر العظام كثافة في جسم الإنسان. عادة ما يتم إجراء إزالة الكلس في حمض النيتريك أو حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) ويستغرق أسابيع إلى أشهر بينما يتطلب التغيير المتكرر للمحاليل 7,9. علاوة على ذلك ، قد تعوق عملية التحضير البطيئة هذه الدراسات الحساسة للوقت للأذن البشرية ، مثل تلك المتعلقة بجائحة COVID-19. تصف هذه الورقة تقنية لتقسيم العظام الصدغية عالية السرعة تستخدم منشارا دقيقا من الماس لتوليد أقسام سميكة تسمح بإزالة الكلس السريع وتحليل الأنسجة في غضون 10-14 يوما من حصاد العظام الصدغي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد أبحاث العظام الصدغية البشرية أمرا بالغ الأهمية لدراسة أمراض الأذن الداخلية والوسطى ولكنها تظل مسعى كثيف الوقت والموارد. تصف هذه الورقة تقنية تستخدم المنشار الدقيق الماسي لتوليد أقسام عظمية صدغية سميكة يمكن إزالتها بسرعة قبل مزيد من التقسيم بحيث يمكن تقليل الوقت من حصاد الأنسجة إلى ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر محمد ليهار على مساعدته في هذا المشروع. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (T32DC000027 ، NSA).
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. . Pathology of the Ear. , (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science–and art–of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. . Pathology of the Ear and Temporal Bone. , (1993).
- . COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022)
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
- Wu, P. Z., O’Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
