COVID-19関連中耳病理の評価のための高速ヒト側頭骨切片化
Summary
この記事では、ツインダイヤモンドブレードを備えたマイクロソーを使用して薄いスライスを生成し、迅速な脱灰と時間的骨免疫組織化学の分析を行う、迅速なヒト側頭骨切片化の技術について説明します。
Abstract
ヒト側頭骨切片の組織病理学的解析は、内耳および中耳の病理学を研究するための基本的な技術である。側頭骨切片は、死後側頭骨収穫、固定、脱灰、包埋、および染色によって調製される。側頭骨の密度のために、脱灰は時間がかかり、資源集約的なプロセスである。完全な組織調製には、平均して9〜10ヶ月かかることがあります。これは、耳病理学研究を遅らせ、COVID-19パンデミックに関連するような時間に敏感な研究を妨げます。この論文では、組織処理を高速化するために、側頭骨切片の迅速な調製および脱灰のための技術について述べる。
側頭骨を標準的な技術を用いて死後に採取し、10%ホルマリンで固定した。ツインダイヤモンドブレードを備えた精密マイクロソーを使用して、各セクションを3つの厚いセクションに切断しました。次いで、厚い側頭骨切片を脱灰溶液中で7〜10日間脱灰してからパラフィンに包埋し、凍結トームを用いて薄い(10μm)切片に切片化し、荷電していないスライドに取り付けた。次いで、組織サンプルを脱パラフィン処理し、抗体染色のために再水和し(ACE2、TMPRSS2、フューリン)、画像化した。この技術により、収穫から組織分析までの時間が9〜10ヶ月から10〜14日に短縮されました。高速の側頭骨切片化は、COVID-19に関連するような時間に敏感な研究を促進しながら、耳病理研究のスピードを高め、組織調製に必要なリソースを減らす可能性があります。
Introduction
人間の側頭骨研究は、内耳と中耳の病理学と病態生理学を研究するための非常に貴重なリソースを提供します。19世紀以前は、耳鼻咽喉科疾患1,2,3についてはほとんど知られていなかった。耳鼻咽喉科疾患をよりよく理解し、「うんざりの手から聴覚手術を救う」ために、ジョセフ・トインビー(1815-1866)は、人間の側頭骨の組織学的切片を研究する方法を開発しました3。この研究は、19世紀の残りの期間にウィーンのアダム・ポリッツァー(1835-1920)とヨーロッパ中の他の人々によって促進され、彼らは側頭骨セクションを使用して耳に影響を与える多くの一般的な状態の組織病理学を記述しました2,3,4。
米国で最初のヒト側頭骨研究所は、1927年にジョンズホプキンス病院に開設され、ステイシーギルド(1890-1966)が側頭骨切片化の方法を開発しました5,6。ギルドが開発した方法は、死後の収穫、固定、硝酸中の脱灰、エタノール中の脱水、セロイジン埋め込み、切片化、染色、および取り付けを含む9〜10ヶ月のプロセスで構成されていました。この技術への修正は後にハロルド・シュクネヒト(1917-1996)によって行われました7;ただし、このプロセスの基本コンポーネントは基本的に変更されません。
側頭骨検査室を維持するために必要な重要なリソースは、側頭骨研究の課題を提示し、おそらく過去30年間でその人気の低下に貢献しています4,8。側頭骨検査室のリソースの大部分は、側頭骨準備の9-10ヶ月のプロセスに捧げられなければなりません。準備の最も時間のかかるステップの1つは、人体で最も密度の高い骨である側頭骨の脱灰です。脱灰は、典型的には硝酸またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)中で行われ、溶液7,9の頻繁な交換を必要としながら数週間から数ヶ月かかる。さらに、COVID-19パンデミックに関連するものなど、人間の耳の時間に敏感な研究は、この遅い準備プロセスによって妨げられる可能性があります。この論文では、ダイヤモンドマイクロソーを使用して厚い切片を生成し、時間的骨収穫から10〜14日以内に迅速な脱灰と組織分析を可能にする高速側頭骨切片化の技術について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト側頭骨研究は、内耳および中耳の病理学を研究するために不可欠ですが、時間とリソースを大量に消費する努力のままです。この論文では、ダイヤモンドマイクロソーを使用して、組織の収穫から研究までの時間を9〜10ヶ月から10〜14日に短縮できるように、さらなる切片化の前に急速に脱灰することができる厚い側頭骨切片を生成する技術について説明します。この技術は、時間的骨処…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、このプロジェクトに対するモハメド・レハールの支援に感謝する。この研究は、国立衛生研究所(T32DC000027、NSA)によって部分的に支援されました。
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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