Sezionamento dell'osso temporale umano ad alta velocità per la valutazione della patologia dell'orecchio medio associata a COVID-19
Summary
Questo articolo descrive una tecnica per il sezionamento rapido dell’osso temporale umano che utilizza una microsega con due dischi diamantati per generare fette sottili per una rapida decalcificazione e analisi dell’immunoistochimica ossea temporale.
Abstract
L’analisi istopatologica delle sezioni ossee temporali umane è una tecnica fondamentale per lo studio della patologia dell’orecchio interno e medio. Le sezioni ossee temporali sono preparate mediante raccolta ossea temporale post-mortem, fissazione, decalcificazione, incorporamento e colorazione. A causa della densità dell’osso temporale, la decalcificazione è un processo che richiede tempo e risorse; la preparazione completa dei tessuti può richiedere in media 9-10 mesi. Ciò rallenta la ricerca otopatologica e ostacola gli studi sensibili al fattore tempo, come quelli rilevanti per la pandemia di COVID-19. Questo documento descrive una tecnica per la rapida preparazione e decalcificazione delle sezioni ossee temporali per accelerare l’elaborazione dei tessuti.
Le ossa temporali sono state raccolte post mortem utilizzando tecniche standard e fissate in formalina al 10%. Una microsega di precisione con due lame diamantate è stata utilizzata per tagliare ogni sezione in tre sezioni spesse. Sezioni ossee temporali spesse sono state poi decalcificate in soluzione decalcificante per 7-10 giorni prima di essere incorporate nella paraffina, sezionate in sezioni sottili (10 μm) usando un criotomo e montate su vetrini non caricati. I campioni di tessuto sono stati quindi deparaffinati e reidratati per la colorazione degli anticorpi (ACE2, TMPRSS2, Furin) e ripresi. Questa tecnica ha ridotto il tempo dalla raccolta all’analisi dei tessuti da 9-10 mesi a 10-14 giorni. Il sezionamento osseo temporale ad alta velocità può aumentare la velocità della ricerca otopatologica e ridurre le risorse necessarie per la preparazione dei tessuti, facilitando al contempo studi sensibili al tempo come quelli relativi a COVID-19.
Introduction
La ricerca sull’osso temporale umano fornisce una risorsa inestimabile per studiare la patologia e la fisiopatologia dell’orecchio interno e medio. Prima del 19 ° secolo, si sapeva poco per quanto riguarda la malattiaotologica 1,2,3. Per comprendere meglio la malattia otologica e “salvare la chirurgia uditiva dalle mani dei ciarlatani”, Joseph Toynbee (1815-1866) sviluppò metodi per studiare le sezioni istologiche dell’osso temporale umano3. Questo lavoro è stato promosso da Adam Politzer (1835-1920) a Vienna e altri in tutta Europa durante il resto del 19 ° secolo, che ha usato sezioni ossee temporali per descrivere l’istopatologia di molte condizioni comuni che interessano l’orecchio 2,3,4.
Il primo laboratorio di ossa temporali umane negli Stati Uniti fu aperto nel 1927 al Johns Hopkins Hospital, dove Stacy Guild (1890-1966) sviluppò metodi per il sezionamento dell’osso temporale 5,6. I metodi sviluppati da Guild consistevano in un processo di 9-10 mesi che includeva la raccolta post-mortem, la fissazione, la decalcificazione in acido nitrico, la disidratazione in etanolo, l’incorporamento di celloidin, il sezionamento, la colorazione e il montaggio. Le modifiche a questa tecnica furono successivamente apportate da Harold Schuknecht (1917-1996)7; tuttavia, le componenti di base di questo processo rimangono sostanzialmente invariate.
Le risorse significative necessarie per mantenere un laboratorio di osso temporale hanno rappresentato una sfida per la ricerca sull’osso temporale e probabilmente hanno contribuito al declino della sua popolarità negli ultimi 30 anni 4,8. Una parte significativa delle risorse di laboratorio dell’osso temporale deve essere dedicata al processo di 9-10 mesi di preparazione dell’osso temporale. Una delle fasi più dispendiose in termini di tempo nella preparazione è la decalcificazione dell’osso temporale, che è l’osso più denso del corpo umano. La decalcificazione viene tipicamente eseguita in acido nitrico o acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e richiede settimane o mesi mentre richiede il frequente cambio di soluzioni 7,9. Inoltre, gli studi sensibili al tempo dell’orecchio umano, come quelli relativi alla pandemia di COVID-19, possono essere ostacolati da questo lento processo di preparazione. Questo documento descrive una tecnica per il sezionamento osseo temporale ad alta velocità che utilizza una microsega a diamante per generare sezioni spesse che consentono una rapida decalcificazione e analisi dei tessuti entro 10-14 giorni dalla raccolta dell’osso temporale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ricerca sull’osso temporale umano è fondamentale per lo studio della patologia dell’orecchio interno e medio, ma rimane uno sforzo ad alta intensità di tempo e risorse. Questo documento descrive una tecnica che utilizza una microsega diamanta per generare sezioni ossee temporali spesse che possono essere rapidamente decalcificate prima di ulteriori sezioni in modo che il tempo dalla raccolta dei tessuti allo studio possa essere ridotto da 9-10 mesi a 10-14 giorni. Questa tecnica può ridurre le risorse necessarie pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Mohamed Lehar per la sua assistenza in questo progetto. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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