Sectionnement osseux temporal humain à grande vitesse pour l’évaluation de la pathologie de l’oreille moyenne associée à la COVID-19
Summary
Cet article décrit une technique de section osseuse temporale humaine rapide qui utilise une micro scie à lames de diamant jumelles pour générer de fines tranches de décalcification rapide et l’analyse de l’immunohistochimie osseuse temporale.
Abstract
L’analyse histopathologique des sections osseuses temporales humaines est une technique fondamentale pour étudier la pathologie de l’oreille interne et moyenne. Les coupes osseuses temporales sont préparées par prélèvement osseux temporal post-mortem, fixation, décalcification, encastrement et coloration. En raison de la densité de l’os temporal, la décalcification est un processus long et gourmand en ressources; la préparation complète des tissus peut prendre de 9 à 10 mois en moyenne. Cela ralentit la recherche en otopathologie et entrave les études urgentes, telles que celles pertinentes pour la pandémie de COVID-19. Cet article décrit une technique de préparation et de décalcification rapides des coupes osseuses temporales pour accélérer le traitement des tissus.
Les os temporaux ont été récoltés après l’autopsie à l’aide de techniques standard et fixés dans 10% de formol. Une micro scie de précision avec deux lames diamantées a été utilisée pour couper chaque section en trois sections épaisses. Les coupes osseuses temporales épaisses ont ensuite été décalcifiées dans une solution décalcifiante pendant 7 à 10 jours avant d’être incorporées dans de la paraffine, sectionnées en sections minces (10 μm) à l’aide d’un cryotome et montées sur des lames non chargées. Les échantillons de tissus ont ensuite été déparaffinisés et réhydratés pour la coloration des anticorps (ACE2, TMPRSS2, Furin) et imagés. Cette technique a réduit le temps entre la récolte et l’analyse des tissus de 9-10 mois à 10-14 jours. La section osseuse temporale à grande vitesse peut augmenter la vitesse de la recherche en otopathologie et réduire les ressources nécessaires à la préparation des tissus, tout en facilitant les études urgentes telles que celles liées à la COVID-19.
Introduction
La recherche sur les os temporaux humains fournit une ressource inestimable pour étudier la pathologie et la physiopathologie de l’oreille interne et moyenne. Avant le 19ème siècle, on savait peu de choses sur les maladies otologiques 1,2,3. Pour mieux comprendre les maladies otologiques et « sauver la chirurgie auditive des mains des charlatans », Joseph Toynbee (1815-1866) a développé des méthodes pour étudier les sections histologiques de l’os temporal humain3. Ce travail a été poursuivi par Adam Politzer (1835-1920) à Vienne et dans d’autres à travers l’Europe pendant le reste du 19ème siècle, qui a utilisé des sections osseuses temporales pour décrire l’histopathologie de nombreuses conditions courantes affectant l’oreille 2,3,4.
Le premier laboratoire d’os temporaux humains aux États-Unis a été ouvert en 1927 à l’hôpital Johns Hopkins, où Stacy Guild (1890-1966) a développé des méthodes de section osseuse temporale 5,6. Les méthodes développées par Guild consistaient en un processus de 9 à 10 mois qui comprenait la récolte post-mortem, la fixation, la décalcification dans l’acide nitrique, la déshydratation dans l’éthanol, l’incorporation de celloïdine, le sectionnement, la coloration et le montage. Des modifications à cette technique ont ensuite été apportées par Harold Schuknecht (1917-1996)7; toutefois, les éléments de base de ce processus demeurent essentiellement inchangés.
Les ressources importantes nécessaires pour maintenir un laboratoire d’os temporal ont représenté un défi pour la recherche sur les os temporaux et ont probablement contribué à sa popularité déclinante au cours des 30 dernières années 4,8. Une partie importante des ressources du laboratoire osseux temporal doit être consacrée au processus de préparation osseuse temporale de 9 à 10 mois. L’une des étapes les plus longues de la préparation est la décalcification de l’os temporal, qui est l’os le plus dense du corps humain. La décalcification est généralement effectuée dans l’acide nitrique ou l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et prend des semaines à des mois tout en nécessitant le changement fréquent de solutions 7,9. De plus, les études urgentes de l’oreille humaine, telles que celles liées à la pandémie de COVID-19, peuvent être entravées par ce lent processus de préparation. Cet article décrit une technique de section osseuse temporale à grande vitesse qui utilise une microsevis diamantée pour générer des sections épaisses qui permettent une décalcification rapide et une analyse tissulaire dans les 10 à 14 jours suivant la récolte osseuse temporale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La recherche sur les os temporaux humains est essentielle pour étudier la pathologie de l’oreille interne et moyenne, mais reste une entreprise exigeante en temps et en ressources. Cet article décrit une technique qui utilise une microse à diamant pour générer des coupes osseuses temporales épaisses qui peuvent être rapidement décalcifiées avant d’autres coupes afin que le temps entre la récolte des tissus et l’étude puisse être réduit de 9-10 mois à 10-14 jours. Cette technique peut réduire les ress…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mohamed Lehar pour son aide dans ce projet. Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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