Summary

COVID-19 ile İlişkili Orta Kulak Patolojisinin Değerlendirilmesi için Yüksek Hızlı İnsan Temporal Kemik Kesiti

Published: May 18, 2022
doi:

Summary

Bu makalede, temporal kemik immünohistokimyasının hızlı dekalsifikasyonu ve analizi için ince dilimler oluşturmak üzere ikiz elmas bıçaklı bir mikro testere kullanan hızlı insan temporal kemik kesitleme tekniği açıklanmaktadır.

Abstract

İnsan temporal kemik kesitlerinin histopatolojik analizi, iç ve orta kulak patolojisini incelemek için temel bir tekniktir. Temporal kemik kesitleri postmortem temporal kemik hasadı, fiksasyon, dekalsifikasyon, gömme ve boyama ile hazırlanır. Temporal kemiğin yoğunluğu nedeniyle, dekalsifikasyon zaman alıcı ve kaynak yoğun bir işlemdir; tam doku hazırlığı ortalama 9-10 ay sürebilir. Bu, otopatoloji araştırmalarını yavaşlatır ve COVID-19 pandemisiyle ilgili olanlar gibi zamana duyarlı çalışmaları engeller. Bu yazıda, doku işlemeyi hızlandırmak için temporal kemik kesitlerinin hızlı hazırlanması ve kireçlenmesi için bir teknik anlatılmaktadır.

Temporal kemikler standart teknikler kullanılarak postmortem olarak toplandı ve% 10 formalin ile sabitlendi. Her bölümü üç kalın bölüme ayırmak için ikiz elmas bıçaklı hassas bir mikro testere kullanıldı. Kalın temporal kemik kesitleri daha sonra parafine gömülmeden önce 7-10 gün boyunca kireç çözücü çözeltide dekalsifiye edildi, bir kriyotom kullanılarak ince (10 μm) bölümlere ayrıldı ve yüksüz slaytlara monte edildi. Doku örnekleri daha sonra deparafinize edildi ve antikor boyama (ACE2, TMPRSS2, Furin) için rehidre edildi ve görüntülendi. Bu teknik, hasattan doku analizine kadar geçen süreyi 9-10 aydan 10-14 güne indirdi. Yüksek hızlı temporal kemik kesitleme, otopatoloji araştırmalarının hızını artırabilir ve doku hazırlığı için gerekli kaynakları azaltabilirken, COVID-19 ile ilgili olanlar gibi zamana duyarlı çalışmaları da kolaylaştırabilir.

Introduction

İnsan temporal kemik araştırması, iç ve orta kulağın patolojisini ve patofizyolojisini incelemek için paha biçilmez bir kaynak sağlar. 19. yüzyıldan önce, otolojik hastalık 1,2,3 hakkında çok az şey biliniyordu. Otolojik hastalığı daha iyi anlamak ve “işitsel cerrahiyi şarlatanların elinden kurtarmak” için Joseph Toynbee (1815-1866), insan temporal kemiğinin histolojik bölümlerini incelemek için yöntemler geliştirdi3. Bu çalışma, Viyana’da ve 19. yüzyılın geri kalanında Avrupa’daki diğer kişilerde Adam Politzer (1835-1920) tarafından ilerletildi ve kulak 2,3,4’ü etkileyen birçok yaygın durumun histopatolojisini tanımlamak için temporal kemik kesitlerini kullandı.

Amerika Birleşik Devletleri’ndeki ilk insan temporal kemik laboratuvarı, Stacy Guild’in (1890-1966)temporal kemik kesiti 5,6 için yöntemler geliştirdiği Johns Hopkins Hastanesi’nde 1927’de açıldı. Guild tarafından geliştirilen yöntemler, ölüm sonrası hasat, fiksasyon, nitrik asitte kireçlenme, etanolde dehidrasyon, celloidin gömme, kesitleme, boyama ve montajı içeren 9-10 aylık bir süreçten oluşuyordu. Bu teknikte değişiklikler daha sonra Harold Schuknecht (1917-1996)7 tarafından yapılmıştır; Bununla birlikte, bu sürecin temel bileşenleri esasen değişmeden kalır.

Bir temporal kemik laboratuvarını sürdürmek için gereken önemli kaynaklar, temporal kemik araştırması için bir zorluk oluşturmuş ve muhtemelen son 30 yılda azalan popülaritesine katkıda bulunmuştur 4,8. Temporal kemik laboratuar kaynaklarının önemli bir kısmı 9-10 aylık temporal kemik preparasyonu sürecine ayrılmalıdır. Hazırlıkta en çok zaman alan adımlardan biri, insan vücudundaki en yoğun kemik olan temporal kemiğin kireçlenmesidir. Dekalsifikasyon tipik olarak nitrik asit veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde gerçekleştirilir ve çözeltilerin sık sık değiştirilmesini gerektirirken haftalar ila aylar sürer 7,9. Ayrıca, COVID-19 pandemisi ile ilgili olanlar gibi insan kulağının zamana duyarlı çalışmaları, bu yavaş hazırlık süreci tarafından engellenebilir. Bu yazıda, temporal kemik hasadından sonraki 10-14 gün içinde hızlı dekalsifikasyon ve doku analizine izin veren kalın kesitler oluşturmak için elmas mikro testere kullanan yüksek hızlı temporal kemik kesitleme tekniği açıklanmaktadır.

Protocol

Bu protokol IRB (IRB00250002) onayı ile ve insan dokusu ve enfeksiyöz materyal kullanımına yönelik kurumsal politikalara uygun olarak geliştirilmiştir. Her temporal kemik donörü ölümden önce yazılı onay verdi veya doğumdan sonra donörün ailesinden onay alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu’na bakın. 1. Temporal kemik hasadı Bu protokolü kullanma…

Representative Results

Orta kulak mukozası ve östaki tüpünün hematoksilin ve eozin boyaması, işlem sonrasında orta kulak mukozasının ve submukozal orta kulak dokusunun korunduğunu gösterdi (Şekil 1). İmmünohistokimyasal görüntülerde orta kulak mukozası ve östaki tüpü içinde ACE2, TMPRSS2 ve Furin proteinlerinin ekspresyonu görüldü (Şekil 1). Bu proteinlerin orta kulaktaki varlığı, SARS-CoV-2’nin orta kulaktaki solunum epitelini enfekte edebileceği olası…

Discussion

İnsan temporal kemik araştırması, iç ve orta kulak patolojisini incelemek için kritik öneme sahiptir, ancak zaman ve kaynak yoğun bir çaba olmaya devam etmektedir. Bu makalede, daha fazla bölümlemeden önce hızla dekalsifiye edilebilen kalın temporal kemik kesitleri oluşturmak için elmas mikro testere kullanan bir teknik açıklanmaktadır, böylece doku hasadından çalışmaya kadar geçen süre 9-10 aydan 10-14 güne düşürülebilir. Bu teknik, temporal kemik işleme için gereken kaynakları azaltabi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Mohamed Lehar’a bu projedeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32DC000027, NSA) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) Novus Biologicals SN0754
Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) Abcam EPR 14674
Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) Novus Biologicals NBP1-20984
BX43 Manual System Microscope Olympus Life Science Solutions
CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade Pace Technologies WB-007GP
Collin Mallet – 8'' Surgical Mart SM1517
DS-Fi3 Microscope Camera Nikon
Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) Dako S2003
Eaosin Stain Sigma-Aldrich 548-24-3
Formalin solution, neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) StatLab 1214-1 GAL
Hematoxylin Stain Sigma-Aldrich H9627
HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) Leica Biosystems PV6119
ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) Vector Laboratories MP-7405
Lambotte Osteotome Surgical Mart SM1553
Metallographic PICO 155P Precision Saw Pace Technologies PICO 155P microsaw
NIS Elements Software Version 4.6 Nikon
Paraplast Plus Sigma-Aldrich P3683 paraffin
Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End Walter Products 1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome New Life Scientific Inc. A78900104 cryotome
Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) Sigma-Aldrich 920P-05
Xylene Sigma-Aldrich 920P-05

References

  1. Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
  2. Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
  3. Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
  4. Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
  5. Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
  6. Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
  7. Schuknecht, H. . Pathology of the Ear. , (1993).
  8. Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science–and art–of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
  9. Nager, G. T. . Pathology of the Ear and Temporal Bone. , (1993).
  10. . COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022)
  11. Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
  12. Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
  13. Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
  14. Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
  15. Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
  16. McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
  17. Wu, P. Z., O’Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
  18. Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
  19. Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).

Play Video

Cite This Article
Andresen, N. S., Wood, M. K., Čiháková, D., Stewart, C. M. High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology. J. Vis. Exp. (183), e64012, doi:10.3791/64012 (2022).

View Video