Protokollen viser, at ved at udføre mikrotransplantation af synaptiske membraner i Xenopus laevis oocytter er det muligt at registrere konsistente og pålidelige reaktioner af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre og γ-aminosmørsyrereceptorer.
Excitatoriske og hæmmende ionotrope receptorer er de vigtigste porte af ionfluxer, der bestemmer aktiviteten af synapser under fysiologisk neuronal kommunikation. Derfor er ændringer i deres overflod, funktion og forhold til andre synaptiske elementer blevet observeret som en vigtig korrelation af ændringer i hjernefunktion og kognitiv svækkelse i neurodegenerative sygdomme og psykiske lidelser. At forstå, hvordan funktionen af excitatoriske og hæmmende synaptiske receptorer ændres af sygdom, er af afgørende betydning for udviklingen af effektive terapier. For at få sygdomsrelevant information er det vigtigt at registrere den elektriske aktivitet af neurotransmitterreceptorer, der forbliver funktionelle i den syge menneskelige hjerne. Indtil videre er dette den nærmeste tilgang til vurdering af patologiske ændringer i receptorernes funktion. I dette arbejde præsenteres en metode til at udføre mikrotransplantation af synaptiske membraner, som består i at reaktivere synaptiske membraner fra snapfrosset humant hjernevæv indeholdende humane receptorer ved injektion og posterior fusion i membranen af Xenopus laevis oocytter. Protokollen giver også den metodologiske strategi for at opnå konsistente og pålidelige reaktioner af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) og γ-aminosmørsyre (GABA) receptorer samt nye detaljerede metoder, der anvendes til normalisering og streng dataanalyse.
Neurodegenerative lidelser påvirker en stor procentdel af befolkningen. Selvom deres ødelæggende konsekvenser er velkendte, er forbindelsen mellem de funktionelle ændringer af neurotransmitterreceptorer, som er kritiske for hjernens funktion, og deres symptomatologi stadig dårligt forstået. Interindividuel variation, sygdommens kroniske karakter og snigende symptomdebut er blot nogle af de årsager, der har forsinket forståelsen af de mange hjernesygdomme, hvor kemiske ubalancer er veldokumenterede 1,2. Dyremodeller har genereret uvurderlig information og udvidet vores viden om de mekanismer, der ligger til grund for fysiologi og patofysiologi i evolutionære bevarede systemer; imidlertid udelukker flere interspecies forskelle mellem gnavere og mennesker den direkte ekstrapolering af receptorfunktionen fra dyremodeller til den menneskelige hjerne3. Således blev de indledende bestræbelser på at studere indfødte humane receptorer udviklet af Ricardo Miledis laboratorium ved hjælp af kirurgisk fjernet væv og frosne prøver. Disse indledende eksperimenter anvendte hele membraner, der inkluderer neuronale synaptiske og ekstra synaptiske receptorer samt ikke-neuronale neurotransmitterreceptorer, og selvom de giver vigtige oplysninger om syge tilstande, er der bekymring for, at blandingen af receptorer komplicerer fortolkningen af data 4,5,6,7. Det er vigtigt, at synapser er det vigtigste mål i mange neurodegenerative lidelser 8,9; derfor er assays for at teste de funktionelle egenskaber af berørte synapser grundlæggende for at få information om sygdomsrelevante ændringer, der påvirker synaptisk kommunikation. Her beskrives en modifikation af den oprindelige metode: mikrotransplantation af synaptiske membraner (MSM), der fokuserer på den fysiologiske karakterisering af berigede synaptiske proteinpræparater og med succes er blevet anvendt til at studere rotte- og humane synaptosomer 10,11,12,13,14,15 . Med denne metode er det muligt at transplantere synaptiske receptorer, der engang arbejdede i den menneskelige hjerne, indlejret i deres egne indfødte lipider og med deres egen kohorte af associerede proteiner. Da MSM-data er kvantitative, er det desuden muligt at bruge disse data til at integrere med store proteomiske eller sekventerende datasæt10.
Det er vigtigt at bemærke, at mange farmakologiske og biofysiske analyser af synaptiske receptorer udføres på rekombinante proteiner16,17. Mens denne tilgang giver bedre indsigt i receptorernes struktur-funktionsforhold, kan den ikke give information om komplekse multimere receptorkomplekser, der findes i neuroner og deres ændringer i sygdom. Derfor bør en kombination af indfødte og rekombinante proteiner give en mere omfattende analyse af synaptiske receptorer.
Der er mange metoder til at forberede synaptosomer 10,11,12,13,14,15, som kan justeres til kravene i et laboratorium. Protokollen begynder med antagelsen om, at synaptosomale berigede præparater blev isoleret og er klar til at blive behandlet til mikrotransplantationsforsøg. I laboratoriet anvendes Syn-Per-metoden efter producentens anvisninger. Dette gøres på grund af høj reproducerbarhed i elektrofysiologiske eksperimenter 10,11. Der er også rigelig litteratur, der forklarer, hvordan man isolerer Xenopus oocytter18,19, som også kan købes klar til injektion20.
Analyse af indfødte proteinkomplekser fra menneskelige hjerner er nødvendig for at forstå homeostatiske og patologiske processer i hjernesygdomme og udvikle terapeutiske strategier til forebyggelse eller behandling af sygdomme. Hjernebanker, der indeholder snapfrosne prøver, er således en uvurderlig kilde til et stort og for det meste uudnyttet væld af fysiologisk information29,30. En indledende bekymring for at bruge postmortemvæv er den klare mulighed fo…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIA/NIH-tilskud R01AG070255 og R01AG073133 til AL. Vi takker også University of California Irvine Alzheimers sygdomsforskningscenter (UCI-ADRC) for at levere det humane væv, der er vist i dette manuskript. UCI-ADRC er finansieret af NIH/NIA-tilskud P30 AG066519.
For Microinjection | |||
3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
For Two Electrode Voltage clamp | |||
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
Any PC computer or laptop | |||
Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
Reagents | |||
Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
Kainic acid | Tocris | 0222 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |