طريقة ترشيح بسيطة على الطاولة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية
Summary
يوضح هذا البروتوكول كيفية عزل الحويصلات الجذعية الصغيرة خارج الخلية للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري (hUC-MSC-sEVs) باستخدام إعداد بسيط على نطاق المختبر. يتميز توزيع الحجم وتركيز البروتين وعلامات sEVs ومورفولوجيا hUC-MSC-sEVs المعزولة بتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ومقايسة بروتين BCA ، واللطخة الغربية ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، على التوالي.
Abstract
تعتبر العملية القائمة على الطرد المركزي الفائق الطريقة الشائعة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs). ومع ذلك ، فإن العائد من طريقة العزل هذه أقل نسبيا ، وهذه الطرق غير فعالة في فصل الأنواع الفرعية sEV. توضح هذه الدراسة طريقة ترشيح بسيطة على الطاولة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية MSC المشتقة من الحبل السري البشري (hUC-MSC-sEVs) ، والتي تم فصلها بنجاح عن طريق الترشيح الفائق من الوسط المشروط ل hUC-MSCs. تم تمييز توزيع الحجم وتركيز البروتين والعلامات الخارجية (CD9 و CD81 و TSG101) ومورفولوجيا hUC-MSC-sEVs المعزولة بتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ومقايسة بروتين BCA ، واللطخة الغربية ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، على التوالي. كان حجم hUC-MSC-sEVs المعزول 30-200 نانومتر ، مع تركيز جسيم 7.75 × 10 10 جسيمات / مل وتركيز بروتين80 ميكروغرام / مل. لوحظت نطاقات إيجابية للعلامات الخارجية CD9 و CD81 و TSG101. أظهرت هذه الدراسة أن hUC-MSC-sEVs تم عزلها بنجاح من الوسط المكيف hUC-MSCs ، وأظهر التوصيف أن المنتج المعزول استوفى المعايير المذكورة في الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية 2018 (MISEV 2018).
Introduction
وفقا ل MISEV 2018 ، فإن sEVs عبارة عن جسيمات ثنائية الطبقة دهنية غير قابلة للتكرار مع عدم وجود نواة وظيفية ، بحجم 30-200 نانومتر1. تحتوي sEVs المشتقة من MSC على جزيئات إشارات مهمة تلعب أدوارا مهمة في تجديد الأنسجة ، مثل microRNA أو السيتوكينات أو البروتينات. لقد أصبحوا بشكل متزايد “نقطة ساخنة” بحثية في الطب التجديدي والعلاج الخالي من الخلايا. أظهرت العديد من الدراسات أن sEVs المشتقة من MSC فعالة مثل MSCs في علاج الحالات المختلفة ، مثل التعديل المناعي2،3،4،5 ، وتعزيز تكوين العظم6 ، ومرض السكري7،8 ، أو تجديد الأوعية الدموية9،10. مع تقدم تجارب المرحلة المبكرة ، تم تسليط الضوء على ثلاث قضايا رئيسية رئيسية فيما يتعلق بالترجمة السريرية ل MSCs-EVs: إنتاجية EVs ، ونقاء EVs (خالية من حطام الخلايا والملوثات البيولوجية الأخرى مثل البروتين والسيتوكينات) ، وسلامة غشاء الطبقة المزدوجة الفوسفوليبيد للمركبات الكهربائية بعد العزل.
تم تطوير طرق مختلفة لعزل sEVs ، واستغلال الكثافة والشكل والحجم والبروتين السطحي ل sEVs11. الطريقتان الأكثر شيوعا في عزلات sEVs هما التقنيات القائمة على الطرد المركزي الفائق والتقنيات القائمة على الترشيح الفائق.
تعتبر الطرق القائمة على الطرد المركزي الفائق طرقا قياسية ذهبية في عزل المركبات الكهربائية. هناك نوعان من تقنيات الطرد المركزي الفائق التي يتم استخدامها عادة وهما الطرد المركزي التفاضلي والطرد المركزي الفائق التدرج الكثاف. ومع ذلك ، غالبا ما تؤدي طرق الطرد المركزي الفائق إلى انخفاض العائد وتتطلب معدات باهظة الثمن لأجهزة الطرد المركزي فائقة السرعة (100000-200000 × جم)11. علاوة على ذلك ، فإن تقنيات الطرد المركزي الفائق وحدها غير فعالة في فصل الأنواع الفرعية للمركبات الكهربائية (sEVs والمركبات الكهربائية الكبيرة) ، مما يؤدي إلى طبقة رواسب غير نقية11. أخيرا ، يمكن أن يستغرق الطرد المركزي الفائق التدرج الكثافي وقتا طويلا ويتطلب خطوات احترازية إضافية مثل إضافة المخزن المؤقت للسكروز لمنع تلف التدرج أثناء خطوات التسارع والتباطؤ12. وبالتالي ، فإن الطرد المركزي الفائق عادة ما يؤدي إلى عائد منخفض نسبيا وغير قادر على التمييز بين مجموعات مختلفة من المركبات الكهربائية13 ، مما يحد من تطبيقه لإعداد المركبات الكهربائية على نطاق واسع11.
الطريقة الثانية لعزل EV هي عن طريق الترشيح الفائق ، والذي يعتمد على ترشيح الحجم. يعتبر الترشيح الفائق فعالا نسبيا من حيث الوقت والتكلفة مقارنة بالطرد المركزي الفائق ، لأنه لا يتضمن معدات باهظة الثمن أو أوقات معالجة طويلة14. وبالتالي ، يبدو أن الترشيح الفائق هو تقنية عزل أكثر فعالية من طريقتي الطرد المركزي الفائق المذكورتين أعلاه. يمكن أن تكون المنتجات المعزولة أكثر تحديدا بناء على أحجام المسام والعائد الأعلى15. ومع ذلك ، قد تؤدي القوة الإضافية المتكبدة أثناء عملية الترشيح إلى تشوه أو ثوران المركبات الكهربائية16.
اقترحت الورقة الحالية بروتوكولا فعالا من حيث التكلفة والوقت لعزل المركبات الكهربائية المشتقة من MSC للتحليل النهائي والأغراض العلاجية. جمعت الطريقة الموصوفة في هذه الورقة بين طريقة ترشيح بسيطة مع الطرد المركزي على مقاعد البدلاء لعزل المركبات الكهربائية عالية الإنتاجية وذات الجودة العالية من hUC-MSCs لتحليل المصب ، بما في ذلك تحليل حجم الجسيمات ، وفحص العلامات الحيوية ، والتصوير المجهري الإلكتروني.
Protocol
Representative Results
Discussion
EVs هي واحدة من المجموعات الفرعية المهمة للإفراز في MSCs التي تلعب دورا حاسما أثناء العمليات الطبيعية والمرضية. ومع ذلك ، فقد ارتفعت sEVs ، التي يتراوح حجمها بين 30 إلى 200 نانومتر ، كأداة محتملة للعلاج الخالي من الخلايا في العقد الماضي. تم تطوير تقنيات مختلفة لعزل المركبات الكهربائية من MSCs. ومع ذل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم نشر هذا الفيديو من قبل My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. . Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Wei, Y., et al. . Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
