Простой метод настольной фильтрации для выделения небольших внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток человека
Summary
Этот протокол демонстрирует, как изолировать небольшие внеклеточные везикулы мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека (hUC-MSC-sEVs), с помощью простой лабораторной настольной настройки. Распределение по размерам, концентрация белка, маркеры sEVs и морфология изолированных hUC-MSC-sEV характеризуются анализом отслеживания наночастиц, анализом белка BCA, вестерн-блоттингом и просвечивающим электронным микроскопом соответственно.
Abstract
Процесс, основанный на ультрацентрифугировании, считается распространенным методом выделения малых внеклеточных везикул (sEV). Однако выход от этого метода изоляции относительно ниже, и эти методы неэффективны при разделении подтипов sEV. Это исследование демонстрирует простой метод настольной фильтрации для выделения малых внеклеточных везикул МСК, полученных из пуповины человека (hUC-MSC-sEVs), успешно отделенных ультрафильтрацией от кондиционированной среды hUC-MSCs. Распределение по размерам, концентрация белка, экзосомальные маркеры (CD9, CD81, TSG101) и морфология выделенных hUC-MSC-sEV были охарактеризованы с помощью анализа отслеживания наночастиц, анализа белка BCA, вестерн-блоттинга и просвечивающего электронного микроскопа соответственно. Размер изолированных hUC-MSC-sEV составлял 30-200 нм, с концентрацией частиц 7,75 × 10 частиц /мл и концентрацией белка 80 мкг / мл. Наблюдались положительные полосы для экзосомальных маркеров CD9, CD81 и TSG101. Это исследование показало, что hUC-MSC-sEV были успешно выделены из кондиционированной среды hUC-MSCs, а характеристика показала, что выделенный продукт соответствует критериям, указанным в Минимальная информация для исследований внеклеточных везикул 2018 (MISEV 2018).
Introduction
Согласно MISEV 2018, sEV представляют собой нереплицирующиеся липидные бислойные частицы без функционального ядра размером 30-200нм 1. sEV, полученные из MSC, содержат важные сигнальные молекулы, которые играют важную роль в регенерации тканей, такие как микроРНК, цитокины или белки. Они все чаще становятся исследовательской «горячей точкой» в области регенеративной медицины и бесклеточной терапии. Многие исследования показали, что sEV, полученные из МСК, так же эффективны, как и МСК, при лечении различных состояний, таких как иммуномодуляция 2,3,4,5, усиление остеогенеза 6, сахарный диабет 7,8 или регенерация сосудов 9,10. По мере продвижения исследований на ранней стадии были выделены три основных ключевых вопроса, связанных с клинической трансляцией МСК-ЭВ: выход ВВ, чистота ВВ (свободные от клеточного мусора и других биологических загрязнителей, таких как белок и цитокины) и целостность фосфолипидной двухслойной мембраны ВВ после выделения.
Были разработаны различные методы выделения sEV с использованием плотности, формы, размера и поверхностного белка sEVs11. Двумя наиболее распространенными методами изоляции электромобилей являются методы на основе ультрацентрифугирования и ультрафильтрации.
Методы, основанные на ультрацентрифугировании, считаются золотым стандартом при выделении электромобилей. Два типа методов ультрацентрифугирования, которые обычно используются, – это дифференциальное ультрацентрифугирование и ультрацентрифугирование с градиентом плотности. Однако методы ультрацентрифугирования часто приводят к низкому выходу и требуют дорогостоящего оборудования для высокоскоростной ультрацентрифуги (100 000-200 000 × г)11. Кроме того, методы ультрацентрифугирования сами по себе неэффективны при разделении подтипов EV (sEV и больших EV), что приводит к образованию нечистого слояосадка 11. Наконец, ультрацентрифугирование градиента плотности также может занимать много времени и требовать дополнительных мер предосторожности, таких как добавление буфера сахарозы, чтобы предотвратить повреждение градиента на этапах12 ускорения и замедления. Следовательно, ультрацентрифугирование обычно приводит к относительно низкому выходу и не способно различать различные популяции ЭВ13, что ограничивает его применение для крупномасштабной подготовкиЭВ 11.
Второй метод изоляции электромобилей – это ультрафильтрация, основанная на фильтрации по размеру. Ультрафильтрация относительно эффективна по времени и затратам по сравнению с ультрацентрифугированием, поскольку она не требует дорогостоящего оборудования или длительного времени обработки14. Следовательно, ультрафильтрация, по-видимому, является более эффективным методом изоляции, чем оба вышеупомянутых метода ультрацентрифугирования. Изолированные продукты могут быть более конкретными в зависимости от размеров пор и более высокого выхода15. Однако дополнительная сила, возникающая в процессе фильтрации, может привести к деформации или извержению EV16.
В настоящем документе предложен экономичный и эффективный по времени настольный протокол для выделения sEV, полученных из MSC, для последующего анализа и терапевтических целей. Метод, описанный в этой статье, сочетал в себе простой метод фильтрации с настольным центрифугированием для выделения высокопродуктивных и качественных EV из hUC-MSC для последующего анализа, включая анализ размера частиц, анализ биомаркеров и электронно-микроскопическую визуализацию.
Protocol
Representative Results
Discussion
ЭВ являются одним из важных подмножеств секретома в МСК, которые играют решающую роль во время нормальных и патологических процессов. Тем не менее, в последнее десятилетие sEV с диапазоном размеров от 30 до 200 нм стали потенциальным инструментом для бесклеточной терапии. Были разработаны …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Публикация этого видео была поддержана My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. . Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Wei, Y., et al. . Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
