Een eenvoudige benchtop-filtratiemethode om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van menselijke mesenchymale stamcellen

Summary

Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV’s) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV’s worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.

Abstract

Het op ultracentrifugatie gebaseerde proces wordt beschouwd als de gebruikelijke methode voor isolatie van kleine extracellulaire blaasjes (sEV’s). De opbrengst van deze isolatiemethode is echter relatief lager en deze methoden zijn inefficiënt in het scheiden van sEV-subtypen. Deze studie demonstreert een eenvoudige benchtopfiltratiemethode om van menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV’s) te isoleren, met succes gescheiden door ultrafiltratie van het geconditioneerde medium van hUC-MSCs. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, exosomale markers (CD9, CD81, TSG101) en morfologie van de geïsoleerde hUC-MSC-sEV’s werden gekarakteriseerd met respectievelijk nanodeeltjestraceringsanalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop. De grootte van de geïsoleerde hUC-MSC-sEV’s was 30-200 nm, met een deeltjesconcentratie van 7,75 × 10 10 deeltjes / ml en een eiwitconcentratie van⁸⁰ μg / ml. Positieve banden voor exosomale markers CD9, CD81 en TSG101 werden waargenomen. Deze studie toonde aan dat hUC-MSC-sEV’s met succes werden geïsoleerd uit hUC-MSCs geconditioneerd medium, en karakterisering toonde aan dat het geïsoleerde product voldeed aan de criteria vermeld in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Introduction

Volgens MISEV 2018 zijn sEV’s niet-replicerende lipide dubbellaagse deeltjes zonder functionele kern, met een grootte van 30-200 nm¹. MSC-afgeleide sEV’s bevatten belangrijke signaalmoleculen die een belangrijke rol spelen bij weefselregeneratie, zoals microRNA, cytokines of eiwitten. Ze zijn in toenemende mate een “hotspot” voor onderzoek geworden in regeneratieve geneeskunde en celvrije therapie. Veel studies hebben aangetoond dat MSC-afgeleide sEV’s net zo effectief zijn als MSC’s bij de behandeling van verschillende aandoeningen, zoals immunomodulatie 2,3,4,5, het verbeteren van osteogenese ⁶, diabetes mellitus^7,8 of vasculaire regeneratie ^9,10. Naarmate de vroege fase van de proeven vordert, zijn drie belangrijke belangrijke kwesties met betrekking tot de klinische vertaling van MSC’s-EV’s benadrukt: de opbrengst van de EV’s, de zuiverheid van de EV’s (vrij van celresten en andere biologische verontreinigingen zoals eiwitten en cytokines) en de integriteit van het fosfolipide dubbellaagse membraan van de EV’s na isolatie.

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om sEV’s te isoleren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de dichtheid, vorm, grootte en oppervlakte-eiwit van de sEV’s¹¹. De twee meest voorkomende methoden in sEV-isolaties zijn op ultracentrifugatie gebaseerde en op ultrafiltratie gebaseerde technieken.

Op ultracentrifugatie gebaseerde methoden worden beschouwd als gouden standaardmethoden in sEV-isolatie. Twee soorten ultracentrifugatietechnieken die meestal worden gebruikt, zijn differentiële ultracentrifugatie en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Ultracentrifugatiemethoden resulteren echter vaak in een lage opbrengst en vereisen dure apparatuur voor ultracentrifuge met hoge snelheid (100.000-200.000 × g)¹¹. Bovendien zijn ultracentrifugatietechnieken alleen inefficiënt in het scheiden van EV-subtypen (sEV’s en grote EV’s), wat resulteert in een onzuivere sedimentlaag¹¹. Ten slotte kan ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt ook tijdrovend zijn en aanvullende voorzorgsmaatregelen vereisen, zoals toevoeging van sucrosebuffer om de gradiëntschade tijdens versnellings- en vertragingsstappen^{te remmen 12}. Daarom leidt ultracentrifugatie meestal tot een relatief lage opbrengst en is het niet in staat om onderscheid te maken tussen verschillende populaties EV’s¹³, wat de toepassing ervan voor grootschalige EV-preparaten^{beperkt 11}.

De tweede methode van EV-isolatie is via ultrafiltratie, die is gebaseerd op groottefiltratie. Ultrafiltratie is relatief tijd- en kosteneffectief in vergelijking met ultracentrifugatie, omdat het geen dure apparatuur of lange verwerkingstijden met zich meebrengt¹⁴. Ultrafiltratie lijkt dus een effectievere isolatietechniek dan beide bovengenoemde ultracentrifugatiemethoden. De geïsoleerde producten kunnen specifieker zijn op basis van poriegroottes en hogere opbrengst¹⁵. De extra kracht die tijdens het filtratieproces wordt opgelopen, kan echter leiden tot de vervorming of uitbarsting van de EV’s¹⁶.

De huidige paper stelde een kosten- en tijdseffectief benchtop-protocol voor het isoleren van MSC-afgeleide sEV’s voor downstream-analyse en therapeutische doeleinden. De methode die in dit artikel wordt beschreven, combineerde een eenvoudige filtratiemethode met bench-top centrifugatie om hoogrenderende en kwalitatief goede EV’s te isoleren van hUC-MSCs voor downstream-analyse, inclusief deeltjesgrootteanalyse, biomarkertest en elektronenmicroscopische beeldvorming.

Protocol

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt. 1. Menselijke navelstreng mesenchymale stamcellen en cultuur Kweek de hUC-MSCs met een zaaidichtheid van 5 × 103/cm2 in DMEM, aangevuld met 8% Human Platelet Lysate en 1% Pen-Strep. Incubeer de cellen bij 37 °C in 5% CO2. Vervang het celkweekmedium om de 3 dagen om een goede celgroe…

Representative Results

Figuur 2 laat zien dat hUC-MSC-sEV’s een deeltjesgroottemodus hebben bij 53 nm, terwijl andere significante pieken van deeltjesgrootte 96 en 115 nm waren. De concentratie hUC-MSC-sEV’s gemeten door NTA was 7,75 × 1010 deeltjes / ml. De eiwitconcentratie van hUC-MSC-sEV’s gemeten met de BCA-test was ongeveer 80 μg/ml. In western blotting-analyse toonden hUC-MSC-sEV’s positieve banden voor exosomale markers CD9, CD81 en TSG101, maar waren negatief voor …

Discussion

EV’s zijn een van de belangrijke subsets van het secretoom in MSC’s die een cruciale rol spelen tijdens normale en pathologische processen. Echter, sEV’s, met een groottebereik tussen 30 en 200 nm, zijn het afgelopen decennium gestegen als een potentieel hulpmiddel voor celvrije therapie. Er werden verschillende technieken ontwikkeld om sEV’s te isoleren van MSC’s. Differentiële ultracentrifugatie, ultrafiltratie, precipitatie op basis van polymeren, immunoaffiniteitsafvang en op microfluïdica gebaseerde precipitatie h…

Materials

40% acrylamide	Nacalai Tesque	06121-95	Western blot
95% ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Disinfectants
Absolute Methanol	Chemiz	45081	To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate	Chemiz	14475	catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF membrane blocking
bromophenol blue	Nacalai Tesque	05808-61	electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs isolation
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper	ATTO		buffer reservior (Western blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemicals for western blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2	Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde	Nacalai Tesque	02890-45	Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride	Nacalai Tesque	27327-81	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size	ATTO		To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reducing agent for western blot
sodium chloride	Nacalai Tesque	15266-64	Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31606-62	ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope	FEI, USA
tetramethylethylenediamine	Nacalai Tesque	33401-72	chemicals to prepare gel
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager			CCD imager for western blot signal detection