Küçük Hücre Dışı Vezikülleri İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden İzole Etmek için Basit Bir Tezgah Üstü Filtrasyon Yöntemi
Summary
Bu protokol, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin küçük hücre dışı veziküllerinin (hUC-MSC-sEV’ler) basit bir laboratuvar ölçeğinde tezgah üstü ayar ile nasıl izole edileceğini göstermektedir. İzole hUC-MSC-sEV’lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, sEVs belirteçleri ve morfolojisi, sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edilir.
Abstract
Ultra santrifüjleme bazlı işlem, küçük hücre dışı veziküller (sEV’ler) izolasyonu için yaygın bir yöntem olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu izolasyon yönteminden elde edilen verim nispeten daha düşüktür ve bu yöntemler sEV alt tiplerini ayırmada verimsizdir. Bu çalışma, hUC-MSC’lerin şartlandırılmış ortamından ultrafiltrasyon ile başarıyla ayrılan insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı vezikülleri (hUC-MSC-sEV’ler) izole etmek için basit bir tezgah üstü filtrasyon yöntemini göstermektedir. İzole edilmiş hUC-MSC-sEV’lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, ekzozomal belirteçleri (CD9, CD81, TSG101) ve morfolojisi sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edildi. İzole edilmiş hUC-MSC-sEV’lerin boyutu, 7.75 × 10 10 parçacık / mL’lik bir parçacık konsantrasyonu ve 80 μg / mL’lik bir protein konsantrasyonu ile 30-200 nm idi. Ekzozomal belirteçler CD9, CD81 ve TSG101 için pozitif bantlar gözlendi. Bu çalışma, hUC-MSC-sEV’lerin hUC-MSC’lerin şartlandırılmış ortamından başarıyla izole edildiğini ve karakterizasyonun, izole edilen ürünün Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi 2018 (MISEV 2018) tarafından belirtilen kriterleri karşıladığını göstermiştir.
Introduction
MISEV 2018’e göre, sEV’ler, fonksiyonel çekirdeği olmayan, 30-200 nm1 büyüklüğünde, replikasyon yapmayan lipit çift katmanlı parçacıklardır. MSC türevi sEV’ler, mikroRNA, sitokinler veya proteinler gibi doku rejenerasyonunda önemli rol oynayan önemli sinyal molekülleri içerir. Rejeneratif tıpta ve hücresiz tedavide giderek daha fazla araştırma “sıcak noktası” haline geldiler. Birçok çalışma, MSC kaynaklı sEV’lerin, immünomodülasyon 2,3,4,5, osteogenezi arttırma 6, diabetes mellitus7,8 veya vasküler rejenerasyon 9,10 gibi farklı durumların tedavisinde MSC’ler kadar etkili olduğunu göstermiştir. Erken faz denemeleri ilerledikçe, MSC’ler-EV’lerin klinik çevirisi ile ilgili üç ana anahtar konu vurgulanmıştır: EV’lerin verimi, EV’lerin saflığı (hücre kalıntılarından ve protein ve sitokinler gibi diğer biyolojik kirleticilerden arındırılmış) ve izolasyondan sonra EV’lerin fosfolipid çift katmanlı zarının bütünlüğü.
sEV’leri izole etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, sEV’lerin11’in yoğunluğundan, şeklinden, boyutundan ve yüzey proteininden yararlanılmıştır. EV izolasyonlarında en yaygın iki yöntem ultrasantrifüjleme tabanlı ve ultrafiltrasyon bazlı tekniklerdir.
Ultra santrifüjleme bazlı yöntemler, sEV’lerin izolasyonunda altın standart yöntemler olarak kabul edilir. Genellikle kullanılan iki tip ultrasantrifüjleme tekniği, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemedir. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme yöntemleri genellikle düşük verimle sonuçlanır ve yüksek hızlı ultra santrifüj (100.000-200.000 × g) için pahalı ekipman gerektirir11. Ayrıca, ultrasantrifüjleme teknikleri tek başına EV alt tiplerinin (sEV’ler ve büyük EV’ler) ayrılmasında verimsizdir ve saf olmayan bir tortu tabakası11 ile sonuçlanır. Son olarak, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme de zaman alıcı olabilir ve hızlanma ve yavaşlama adımları12 sırasında gradyan hasarını önlemek için sakkaroz tampon ilavesi gibi ek önlem adımları gerektirebilir. Bu nedenle, ultrasantrifüjleme genellikle nispeten düşük bir verime yol açar ve farklı EVs13 popülasyonları arasında ayrım yapamaz, bu da büyük ölçekli EV hazırlığı11 için uygulamasını sınırlar.
İkinci EV izolasyon yöntemi, boyut filtrasyonuna dayanan ultrafiltrasyon yoluyladır. Ultrafiltrasyon, pahalı ekipman veya uzun işleme süreleri içermediğinden ultrasantrifüjlemeye kıyasla nispeten zaman ve maliyet etkindir14. Bu nedenle, ultrafiltrasyon, yukarıda belirtilen her iki ultrasantrifüjleme yönteminden daha etkili bir izolasyon tekniği gibi görünmektedir. İzole edilen ürünler, gözenek boyutlarına ve daha yüksek verime bağlı olarak daha spesifik olabilir15. Bununla birlikte, filtreleme işlemi sırasında ortaya çıkan ek kuvvet, EV’lerin16’sının deformasyonuna veya patlamasına neden olabilir.
Mevcut makale, MSC’den türetilmiş sEV’leri aşağı akış analizi ve terapötik amaçlar için izole etmek için maliyet ve zaman açısından etkili bir tezgah üstü protokol önermiştir. Bu makalede açıklanan yöntem, partikül boyutu analizi, biyobelirteç testi ve elektron mikroskobik görüntüleme dahil olmak üzere aşağı akış analizi için yüksek verimli ve kaliteli EV’leri hUC-MSC’lerden izole etmek için basit bir filtreleme yöntemini tezgah üstü santrifüjleme ile birleştirdi.
Protocol
Representative Results
Discussion
EV’ler, normal ve patolojik süreçler sırasında çok önemli bir rol oynayan MSC’lerdeki sekretomun önemli alt kümelerinden biridir. Bununla birlikte, 30 ila 200 nm arasında bir boyut aralığına sahip olan sEV’ler, son on yılda hücresiz tedavi için potansiyel bir araç olarak artmıştır. sEV’leri MSC’lerden izole etmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, diferansiyel ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon, polimer bazlı çökeltme, immünoaffinite yakalama ve mikroakışkan bazlı …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu videonun yayınlanması My CytoHealth Sdn. Bhd tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. . Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Wei, Y., et al. . Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
