تصور الديناميكيات التوافقية لمستقبلات الغشاء باستخدام FRET أحادي الجزيء
Summary
تقدم هذه الدراسة إجراء مفصلا لإجراء تجارب نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجزيء (smFRET) على مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCRs) باستخدام وضع العلامات الخاصة بالموقع عن طريق دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAA). يوفر البروتوكول دليلا خطوة بخطوة لإعداد عينة smFRET والتجارب وتحليل البيانات.
Abstract
تعد قدرة الخلايا على الاستجابة للإشارات الخارجية ضرورية لتطوير الخلايا ونموها وبقائها. للاستجابة لإشارة من البيئة ، يجب أن تكون الخلية قادرة على التعرف عليها ومعالجتها. تعتمد هذه المهمة بشكل أساسي على وظيفة مستقبلات الغشاء ، التي يتمثل دورها في تحويل الإشارات إلى اللغة الكيميائية الحيوية للخلية. تشكل المستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCRs) أكبر عائلة من بروتينات مستقبلات الغشاء في البشر. من بين GPCRs ، مستقبلات الغلوتامات الأيضية (mGluRs) هي فئة فرعية فريدة تعمل كدايمرات ملزمة وتمتلك مجالا كبيرا خارج الخلية يحتوي على موقع ربط الليغاند. أدت التطورات الحديثة في الدراسات الهيكلية ل mGluRs إلى تحسين فهم عملية تنشيطها. ومع ذلك ، فإن انتشار التغيرات التوافقية واسعة النطاق من خلال mGluRs أثناء التنشيط والتشكيل غير مفهوم بشكل جيد. يعد نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجزيء (smFRET) تقنية قوية لتصور وقياس الديناميكيات الهيكلية للجزيئات الحيوية على مستوى البروتين الواحد. لتصور العملية الديناميكية لتنشيط mGluR2 ، تم تطوير أجهزة استشعار مطابقة فلورية تعتمد على دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAA) التي سمحت بوضع علامات على البروتين الخاص بالموقع دون إزعاج البنية الأصلية للمستقبلات. يشرح البروتوكول الموصوف هنا كيفية إجراء هذه التجارب ، بما في ذلك نهج وضع العلامات UAA الجديد ، وإعداد العينات ، والحصول على بيانات smFRET وتحليلها. هذه الاستراتيجيات قابلة للتعميم ويمكن توسيعها للتحقيق في الديناميكيات التوافقية لمجموعة متنوعة من بروتينات الغشاء.
Introduction
يعتمد نقل المعلومات عبر غشاء البلازما بشكل كبير على وظيفة مستقبلات الغشاء1. يؤدي ارتباط الرباط بالمستقبل إلى تغيير مطابق وتنشيط المستقبلات. غالبا ما تكون هذه العملية ألوستيريك في طبيعتها2. مع أكثر من 800 عضو ، تعد المستقبلات المرتبطة بالبروتين G (GPCRs) أكبر عائلة من مستقبلات الغشاء في البشر3. نظرا لدورها في جميع العمليات الخلوية تقريبا ، أصبحت GPCRs أهدافا مهمة للتطوير العلاجي. في النموذج الأساسي لإشارات GPCR ، يؤدي تنشيط ناهض إلى تغييرات تطابقية للمستقبل الذي ينشط لاحقا مركب بروتين G غير المتجانس عن طريق تبادل الناتج المحلي الإجمالي مقابل GTP في جيب ربط النيوكليوتيدات في Gα. ثم تتحكم الوحدات الفرعية G α-GTP و Gβγ المنشطة في نشاط البروتينات المستجيبة في اتجاه المصب وتنشر سلسلة الإشارات 4,5. تعتمد عملية الإشارة هذه بشكل أساسي على قدرة الأربطة على تغيير الشكل ثلاثي الأبعاد للمستقبل. إن الفهم الميكانيكي لكيفية تحقيق الليغاند لذلك أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات جديدة وتصميم مستقبلات وأجهزة استشعار اصطناعية.
مستقبلات الغلوتامات الأيضية (mGluRs) هي أعضاء في عائلة GPCR من الفئة C وهي مهمة للتأثيرات العصبية البطيئة للغلوتامات وضبط استثارة الخلايا العصبية 6,7. من بين جميع GPCRs ، تعد GPCRs من الفئة C فريدة من نوعها من الناحية الهيكلية من حيث أنها تعمل كدايمرات ملزمة. يحتوي mGluRs على ثلاثة مجالات هيكلية: مجال مصيدة ذبابة الزهرة (VFT) ، والمجال الغني بالسيستين (CRD) ، والمجال عبر الغشاء (TMD)8. التغييرات التوافقية أثناء عملية التنشيط معقدة وتشمل اقتران التشكيل المحلي والعالمي الذي ينتشر على مسافة 12 نانومتر ، فضلا عن التعاون الخافت. التشكيلات الوسيطة ، والترتيب الزمني للدول ، ومعدل الانتقال بين الدول غير معروفة. من خلال اتباع تشكيل المستقبلات الفردية في الوقت الفعلي ، من الممكن تحديد الحالات الوسيطة العابرة وتسلسل التغيرات التوافقية أثناء التنشيط. يمكن تحقيق ذلك من خلال تطبيق نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجزيء 9,10 (smFRET) ، كما تم تطبيقه مؤخرا لتصور انتشار التغيرات التوافقية أثناء تنشيط mGluR2 11. تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية في تجارب FRET في توليد مستشعرات FRET عن طريق الإدخال الخاص بالموقع للفلوروفورات المانحة والمتقبلة في البروتين محل الاهتمام. تم اعتماد استراتيجية دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAA) 12،13،14،15 للتغلب على قيود تقنيات وضع العلامات الفلورية النموذجية الخاصة بالموقع والتي تتطلب إنشاء طفرات أقل من السيستين أو إدخال علامة كبيرة مشفرة وراثيا. وقد سمح ذلك بإعادة الترتيب التوافقي للوصلة الألوستيرية المدمجة الأساسية ، والتي انضمت إلى مجالات ربط الليغاند والإشارات في mGluR2. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم دليل خطوة بخطوة لإجراء تجارب smFRET على mGluR2 ، بما في ذلك نهج وضع العلامات الخاصة بالموقع على mGluR2 مع UAA لربط الفلوروفورات باستخدام تفاعل تسيكل الأزيد المحفز بالنحاس. علاوة على ذلك ، يصف هذا البروتوكول منهجية الالتقاط المباشر لبروتينات الغشاء وتحليل البيانات. البروتوكول الموضح هنا ينطبق أيضا على دراسة الديناميكيات التوافقية لبروتينات الغشاء الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
GPCRs هي بروتينات تعمل على غشاء الخلية لبدء نقل الإشارة. ويتألف العديد من المحافل العالمية للإبلاغ من مجالات متعددة، وتعتمد الإشارات على التفاعل التعاوني بين المجالات. لتعديل خصائص مستقبلات الغشاء هذه ، من الضروري فهم السلوك الديناميكي للمجالات المتعددة. نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجز…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر رضا فابابخش على المناقشات. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01GM140272 (إلى R.V.) ، وصندوق سيرل للقيادة لعلوم الحياة في جامعة نورث وسترن ، ومن قبل اتحاد شيكاغو الطبي الحيوي بدعم من صناديق سيرل في صندوق شيكاغو المجتمعي (إلى R.V). تم دعم B.W.L. من قبل منحة التدريب T32GM-008061 من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS).
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
References
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
- Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
- Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
- Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
- Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
- Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
- Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
- Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
- Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
- Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
- Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
- Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
- Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
- Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
- Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
- Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
- Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
- Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
- Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).
