Summary

1分子FRETを用いた膜受容体の立体構造ダイナミクスの可視化

Published: August 17, 2022
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Summary

この研究では、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)実験を実行するための詳細な手順を示します 非天然アミノ酸(UAA)の取り込み による 部位特異的標識を使用します。このプロトコルは、smFRETサンプル調製、実験、およびデータ分析のためのステップバイステップガイドを提供します。

Abstract

細胞が外部シグナルに応答する能力は、細胞の発生、成長、および生存に不可欠です。環境からの信号に応答するには、細胞がそれを認識して処理できなければなりません。この課題は主に膜受容体の機能に依存しており、その役割はシグナルを細胞の生化学的言語に変換することである。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、ヒトにおける膜受容体タンパク質の最大のファミリーを構成しています。GPCRの中でも、代謝型グルタミン酸受容体(mGluRs)は、絶対二量体として機能し、リガンド結合部位を含む大きな細胞外ドメインを有するユニークなサブクラスです。mGluRの構造研究における最近の進歩は、それらの活性化過程の理解を改善しました。しかし、活性化および調節中のmGluRを介した大規模な立体配座変化の伝播はよくわかっていません。単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)は、生体分子の構造ダイナミクスを単一タンパク質レベルで視覚化および定量化するための強力な手法です。mGluR2活性化の動的プロセスを視覚化するために、非天然アミノ酸(UAA)の取り込みに基づく蛍光立体配座センサーが開発され、受容体の天然構造の摂動なしに部位特異的タンパク質標識が可能になりました。ここで説明するプロトコルでは、新しいUAAラベリングアプローチ、サンプル調製、smFRETデータの取得と分析など、これらの実験の実行方法について説明します。これらの戦略は一般化可能であり、さまざまな膜タンパク質の立体構造ダイナミクスを調べるために拡張することができます。

Introduction

原形質膜を横切る情報の伝達は、膜受容体の機能に大きく依存しています1。受容体へのリガンド結合は、立体構造変化および受容体活性化をもたらす。このプロセスは、本質的にアロステリックであることがよくあります2。800を超えるメンバーを持つGタンパク質共役型受容体(GPCR)は、ヒトにおける膜受容体の最大のファミリーです3。ほぼすべての細胞プロセスにおける役割により、GPCRは治療薬開発の重要な標的となっています。GPCRシグナル伝達の標準モデルでは、アゴニストの活性化は受容体の立体構造変化をもたらし、続いてGαのヌクレオチド結合ポケットでGDPとGTPの交換を介してヘテロ三量体Gタンパク質複合体を活性化します。活性化されたGα-GTPおよびGβγサブユニットは、下流のエフェクタータンパク質の活性を制御し、シグナル伝達カスケードを伝播します4,5このシグナル伝達プロセスは、本質的に、受容体の三次元形状を変化させるリガンドの能力に依存する。リガンドがこれを達成する方法の機構的理解は、新しい治療法を開発し、合成受容体とセンサーを設計するために重要です。

代謝型グルタミン酸受容体(mGluRs)は、クラスC GPCRファミリーのメンバーであり、グルタミン酸の遅い神経調節効果とニューロンの興奮性を調整するために重要です6,7。すべてのGPCRの中で、クラスCのGPCRは、それらが絶対二量体として機能するという点で構造的に独特である。mGluRには、ハエトリソウ(VFT)ドメイン、システインリッチドメイン(CRD)、膜貫通ドメイン(TMD)の3つの構造ドメインが含まれています8。活性化プロセス中の立体配座変化は複雑であり、12 nmの距離にわたって伝播する局所的およびグローバルな立体配座結合、および二量体の協調性が含まれます。中間的な立体配座、状態の時間的秩序、状態間の遷移速度は不明です。個々の受容体の立体構造をリアルタイムで追跡することにより、活性化中の一過性の中間状態と立体構造変化のシーケンスを特定することができます。これは、mGluR2 11の活性化中の立体構造変化の伝播を視覚化するために最近適用されたように、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動9,10(smFRET)を適用することによって達成することができる。FRET実験の重要なステップは、目的のタンパク質にドナーおよびアクセプター蛍光色素を部位特異的に挿入することによるFRETセンサーの生成です。非天然アミノ酸(UAA)取り込み戦略が採用されました12,13,14,15システインレス変異体の作成または大きな遺伝的にコードされたタグの挿入を必要とする典型的な部位特異的蛍光標識技術の限界を克服するため。これにより、mGluR2のリガンド結合ドメインとシグナル伝達ドメインを結合した必須のコンパクトなアロステリックリンカーの立体構造再配列を観察することができました。このプロトコルでは、銅触媒によるアジ化環化反応を用いて蛍光色素を結合させるためのUAAによるmGluR2の部位特異的標識のアプローチなど、mGluR2でsmFRET実験を行うためのステップバイステップガイドを紹介します。さらに、このプロトコルは、膜タンパク質の直接捕捉およびデータ解析のための方法論を記述する。ここで概説したプロトコルは、他の膜タンパク質の立体構造ダイナミクスの研究にも適用できます。

Protocol

プロトコルの全体的なワークフローを 図 1 に示します。 1.サンプルチャンバーの準備 スライドとカバーガラスのクリーニング注意: これらの手順は、スライドの表面とカバーガラスを洗浄し、アミノシラン化の準備をすることを目的としています。表面テザー分子で単一分子蛍光実験を実施するための重要な要件の1つは、不動態化表?…

Representative Results

UAAベースのFRETセンサーの発現と蛍光標識本明細書では、mGluR2(548UAA)のCRD内へのUAA(AZP)の挿入および蛍光標識の例示的な結果が考察される11。前述のように、AZPをmGluR2に挿入するには、改変tRNA合成酵素と相補的tRNA(pIRE4-Azi)を含む改変翻訳機構と、突然変異誘発法を用いて作成された548位のアンバーコドンを含むmGluR2の共発現が必要です(図2A</strong…

Discussion

GPCRは、細胞膜上で作用してシグナル伝達を開始するタンパク質です。多くのGPCRは複数のドメインで構成されており、シグナリングはドメイン間の協調的相互作用に依存しています。これらの膜受容体の特性を調節するためには、複数のドメインの動的挙動を理解することが不可欠です。単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)は、タンパク質の立体構造とダイナミクスをリアルタイムで測定…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

議論してくれたReza Vafabakhshラボのメンバーに感謝します。この作業は、国立衛生研究所の助成金R01GM140272(R.V.へ)、ノースウェスタン大学の生命科学のためのサールリーダーシップ基金、およびシカゴコミュニティトラストのサール基金(R.V.へ)の支援を受けたシカゴ生物医学コンソーシアムによって支援されました。B.W.L.は、国立総合医学研究所(NIGMS)のトレーニング助成金T32GM-008061の支援を受けました。

Materials

(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

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Cite This Article
Banerjee, C., Liauw, B. W., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).

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