Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET
Summary
Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR’s) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.
Abstract
Het vermogen van cellen om te reageren op externe signalen is essentieel voor cellulaire ontwikkeling, groei en overleving. Om te reageren op een signaal uit de omgeving moet een cel het kunnen herkennen en verwerken. Deze taak is voornamelijk afhankelijk van de functie van membraanreceptoren, waarvan de rol is om signalen om te zetten in de biochemische taal van de cel. G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR’s) vormen de grootste familie van membraanreceptorgeiwitten bij de mens. Onder GPCR’s zijn metabotrope glutamaatreceptoren (mGluRs) een unieke subklasse die functioneren als obligate dimeren en een groot extracellulair domein bezitten dat de ligandbindingsplaats bevat. Recente ontwikkelingen in structurele studies van mGluRs hebben het begrip van hun activeringsproces verbeterd. De verspreiding van grootschalige conformatieveranderingen door mGluRs tijdens activering en modulatie is echter slecht begrepen. Single-molecule fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET) is een krachtige techniek om de structurele dynamiek van biomoleculen op het niveau van één eiwit te visualiseren en te kwantificeren. Om het dynamische proces van mGluR2-activering te visualiseren, werden fluorescerende conformatiesensoren op basis van onnatuurlijke aminozuur (OCG) -opname ontwikkeld die sitespecifieke eiwitetikettering mogelijk maakten zonder verstoring van de oorspronkelijke structuur van receptoren. Het hier beschreven protocol legt uit hoe deze experimenten moeten worden uitgevoerd, inclusief de nieuwe UAA-etiketteringsbenadering, monstervoorbereiding en smFRET-gegevensverzameling en -analyse. Deze strategieën zijn generaliseerbaar en kunnen worden uitgebreid om de conformatiedynamiek van een verscheidenheid aan membraaneiwitten te onderzoeken.
Introduction
De overdracht van informatie over het plasmamembraan is sterk afhankelijk van de functie van membraanreceptoren1. Ligandbinding aan een receptor leidt tot een conformatieverandering en receptoractivering. Dit proces is vaak allosterisch van aard2. Met meer dan 800 leden zijn G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR’s) de grootste familie van membraanreceptoren bij mensen3. Vanwege hun rol in bijna alle cellulaire processen zijn GPCR’s belangrijke doelen geworden voor therapeutische ontwikkeling. In het canonieke model van GPCR-signalering resulteert agonistactivering in conformatieveranderingen van de receptor die vervolgens het heterotrimeer G-eiwitcomplex activeren via uitwisseling van GDP voor GTP in de nucleotidebindingszak van Gα. De geactiveerdeG-α-GTP en Gβγ subeenheden regelen vervolgens de activiteit van downstream effectoreiwitten en verspreiden de signaalcascade 4,5. Dit signaleringsproces hangt in wezen af van het vermogen van liganden om de driedimensionale vorm van de receptor te veranderen. Een mechanistisch begrip van hoe liganden dit bereiken, is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën en het ontwerpen van synthetische receptoren en sensoren.
Metabotrope glutamaatreceptoren (mGluRs) zijn leden van de klasse C GPCR-familie en zijn belangrijk voor de langzame neuromodulerende effecten van glutamaat en het afstemmen van neuronale prikkelbaarheid 6,7. Van alle GPCR’s zijn klasse C GPCR’s structureel uniek omdat ze functioneren als obligate dimeren. mGluRs bevatten drie structurele domeinen: het Venus flytrap (VFT) domein, cysteïne-rijk domein (CRD) en transmembraandomein (TMD)8. De conformatieveranderingen tijdens het activeringsproces zijn complex en omvatten lokale en globale conformatiekoppelingen die zich over een afstand van 12 nm voortplanten, evenals dimer cooperativiteit. De tussenliggende conformaties, temporele ordening van toestanden en de snelheid van overgang tussen toestanden zijn onbekend. Door de conformatie van individuele receptoren in realtime te volgen, is het mogelijk om de voorbijgaande tussentoestanden en de volgorde van conformatieveranderingen tijdens activering te identificeren. Dit kan worden bereikt door het toepassen van single-molecule fluorescentieresonantie-energieoverdracht 9,10 (smFRET), zoals onlangs werd toegepast om de voortplanting van conformatieveranderingen tijdens de activering van mGluR211 te visualiseren. Een belangrijke stap in FRET-experimenten is het genereren van FRET-sensoren door locatiespecifieke inbrenging van de donor- en acceptorfluorforen in het eiwit van belang. Een onnatuurlijke aminozuur (OCG) opnamestrategie werd aangenomen 12,13,14,15 om de beperkingen van typische site-specifieke fluorescerende etiketteringstechnologieën te overwinnen die de creatie van cysteïne-loze mutanten of het invoegen van een grote genetisch gecodeerde tag vereisen. Hierdoor kon de conformatieherschikking van de essentiële compacte allosterische linker, die zich bij de ligandbindende en signaleringsdomeinen van mGluR2 voegde, worden waargenomen. In dit protocol wordt een stapsgewijze handleiding gepresenteerd voor het uitvoeren van smFRET-experimenten op mGluR2, inclusief de aanpak voor locatiespecifieke etikettering van mGluR2 met OCG om fluoroforen te bevestigen met behulp van de kopergekatalyseerde azidecyclisatiereactie. Bovendien beschrijft dit protocol de methodologie voor het direct vastleggen van membraaneiwitten en data-analyse. Het hier geschetste protocol is ook van toepassing op het bestuderen van de conformatiedynamiek van andere membraaneiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
GPCR’s zijn eiwitten die op het celmembraan werken om signaaltransductie te initiëren. Veel GPCR’s bestaan uit meerdere domeinen, waarbij signalering afhankelijk is van de coöperatieve interactie tussen de domeinen. Om de eigenschappen van deze membraanreceptoren te moduleren, is het essentieel om het dynamische gedrag van de meerdere domeinen te begrijpen. Single-molecule fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET) is een fluorescentietechniek die het mogelijk maakt om eiwitconformatie en -dynamica in realtime…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken leden van het Reza Vafabakhsh lab voor de gesprekken. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health grant R01GM140272 (aan R.V.), door The Searle Leadership Fund for the Life Sciences aan de Northwestern University en door het Chicago Biomedical Consortium met steun van de Searle Funds van The Chicago Community Trust (aan R.V.). B.W.L. werd ondersteund door de National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
References
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
- Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
- Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
- Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
- Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
- Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
- Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
- Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
- Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
- Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
- Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
- Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
- Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
- Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
- Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
- Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
- Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
- Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
- Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).
