Summary

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR’ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Abstract

Hücrelerin dış sinyallere cevap verme yeteneği, hücresel gelişim, büyüme ve hayatta kalma için gereklidir. Ortamdan gelen bir sinyale yanıt vermek için, bir hücre onu tanıyabilmeli ve işleyebilmelidir. Bu görev esas olarak, rolü sinyalleri hücrenin biyokimyasal diline dönüştürmek olan membran reseptörlerinin işlevine dayanır. G proteinine bağlı reseptörler (GPCR’ler), insanlarda membran reseptör proteinlerinin en büyük ailesini oluşturur. GPCR’ler arasında, metabotropik glutamat reseptörleri (mGluR’ler), zorunlu dimerler olarak işlev gören ve ligand bağlanma bölgesini içeren geniş bir hücre dışı alana sahip benzersiz bir alt sınıftır. mGluR’lerin yapısal çalışmalarındaki son gelişmeler, aktivasyon süreçlerinin anlaşılmasını geliştirmiştir. Bununla birlikte, aktivasyon ve modülasyon sırasında mGluR’ler yoluyla büyük ölçekli konformasyonel değişikliklerin yayılması tam olarak anlaşılamamıştır. Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET), biyomoleküllerin yapısal dinamiklerini tek protein seviyesinde görselleştirmek ve ölçmek için güçlü bir tekniktir. mGluR2 aktivasyonunun dinamik sürecini görselleştirmek için, reseptörlerin doğal yapısını bozmadan bölgeye özgü protein etiketlemesine izin veren doğal olmayan amino asit (UAA) entegrasyonuna dayanan floresan konformasyonel sensörler geliştirilmiştir. Burada açıklanan protokol, yeni UAA etiketleme yaklaşımı, numune hazırlama ve smFRET veri toplama ve analizi dahil olmak üzere bu deneylerin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır. Bu stratejiler genelleştirilebilir ve çeşitli membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini araştırmak için genişletilebilir.

Introduction

Plazma zarı boyunca bilgi aktarımı büyük ölçüde membran reseptörlerinin işlevine bağlıdır1. Bir reseptöre bağlanan ligand, konformasyonel bir değişikliğe ve reseptör aktivasyonuna yol açar. Bu süreç genellikle doğada allosteriktir2. 800’den fazla üyesi olan G proteinine bağlı reseptörler (GPCR’ler), insanlarda membran reseptörlerinin en büyük ailesidir3. Neredeyse tüm hücresel süreçlerdeki rolleri nedeniyle, GPCR’ler terapötik gelişim için önemli hedefler haline gelmiştir. GPCR sinyallemesinin kanonik modelinde, agonist aktivasyonu, daha sonra Gα nükleotid bağlanma cebinde GTP için GDP değişimi yoluyla heterotrimerik G protein kompleksini aktive eden reseptörün konformasyonel değişiklikleriyle sonuçlanır. Aktive edilen Gα-GTP ve Gβγ alt üniteleri daha sonra aşağı akış efektör proteinlerinin aktivitesini kontrol eder ve sinyal kaskadın 4,5’i yayar. Bu sinyal verme işlemi esas olarak ligandların reseptörün üç boyutlu şeklini değiştirme yeteneğine bağlıdır. Ligandların bunu nasıl başardığına dair mekanik bir anlayış, yeni terapötikler geliştirmek ve sentetik reseptörler ve sensörler tasarlamak için kritik öneme sahiptir.

Metabotropik glutamat reseptörleri (mGluR’ler) C sınıfı GPCR ailesinin üyeleridir ve glutamatın yavaş nöromodülatör etkileri ve nöronal uyarılabilirliğin ayarlanması için önemlidir 6,7. Tüm GPCR’ler arasında, C sınıfı GPCR’ler, zorunlu dimerler olarak işlev görmeleri nedeniyle yapısal olarak benzersizdir. mGluR’ler üç yapısal alan içerir: Venüs flytrap (VFT) alanı, sistein bakımından zengin etki alanı (CRD) ve transmembran alanı (TMD)8. Aktivasyon işlemi sırasındaki konformasyonel değişiklikler karmaşıktır ve 12 nm mesafeye yayılan yerel ve küresel konformasyonel kuplajın yanı sıra dimer kooperatifçiliğini de içerir. Ara konformasyonlar, devletlerin zamansal sıralaması ve devletler arasındaki geçiş hızı bilinmemektedir. Bireysel reseptörlerin konformasyonunu gerçek zamanlı olarak takip ederek, geçici ara durumları ve aktivasyon sırasında konformasyonel değişikliklerin sırasını tanımlamak mümkündür. Bu, mGluR2 11’in aktivasyonu sırasında konformasyonel değişikliklerin yayılımını görselleştirmek için yakın zamanda uygulandığı gibi, tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi 9,10 (smFRET) uygulanarak elde edilebilir. FRET deneylerinde önemli bir adım, donör ve alıcı floroforların ilgili proteine bölgeye özgü yerleştirilmesiyle FRET sensörlerinin üretilmesidir. Sisteinsiz mutantların oluşturulmasını veya genetik olarak kodlanmış büyük bir etiketin eklenmesini gerektiren tipik bölgeye özgü floresan etiketleme teknolojilerinin sınırlamalarının üstesinden gelmek için doğal olmayan bir amino asit (UAA) birleştirme stratejisi 12,13,14,15 benimsenmiştir. Bu, mGluR2’nin ligand bağlama ve sinyal alanlarını birleştiren temel kompakt allosterik bağlayıcının konformasyonel olarak yeniden düzenlenmesinin gözlenmesine izin verdi. Bu protokolde, bakır katalizörlü azid siklizasyon reaksiyonunu kullanarak floroforları bağlamak için mGluR2’nin UAA ile sahaya özgü etiketlenmesi yaklaşımı da dahil olmak üzere, mGluR2 üzerinde smFRET deneyleri gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sunulmaktadır. Ayrıca, bu protokol membran proteinlerinin doğrudan yakalanması ve veri analizi için metodolojiyi açıklamaktadır. Burada özetlenen protokol, diğer membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini incelemek için de geçerlidir.

Protocol

Protokolün genel iş akışı Şekil 1’de açıklanmıştır. 1. Numune odasının hazırlanması Sürgü ve kapak kayması temizliğiNOT: Bu adımlar, kızakların yüzeylerini ve kapak kaymalarını temizlemeyi ve bunları aminosilanizasyona hazırlamayı amaçlamaktadır. Yüzeye bağlı moleküller üzerinde tek moleküllü floresan deneyleri yapmak için kritik bir gereklilik, pasifleştirilmiş bir yüzeydir. En güvenilir ve tekrarlanabil…

Representative Results

UAA tabanlı FRET sensörünün ekspresyon ve floresan etiketlemesiBurada, mGluR2 (548UAA) CRD’si içinde bir UAA’nın (AZP) yerleştirilmesi ve floresan etiketlemesinin örnek sonuçları tartışılmıştır11. Daha önce de belirtildiği gibi, AZP’yi mGluR2’ye yerleştirmek için, modifiye edilmiş bir tRNA sentetaz ve tamamlayıcı tRNA (pIRE4-Azi) içeren mühendislik translasyonel makinesinin ve mutagenez kullanılarak oluşturulan 548 pozisyonunda bir amber kodon içere…

Discussion

GPCR’ler, sinyal iletimini başlatmak için hücre zarı üzerinde çalışan proteinlerdir. Birçok GPCR, birden fazla alandan oluşur ve sinyalleme, etki alanları arasındaki işbirlikçi etkileşime bağlıdır. Bu membran reseptörlerinin özelliklerini modüle etmek için, çoklu alanların dinamik davranışını anlamak önemlidir. Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET), protein konformasyonu ve dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak ölçülmesini sağlayan bir floresan tekniğidir<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reza Vafabakhsh laboratuvarı üyelerine tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R01GM140272 (R.V.’ye), Northwestern Üniversitesi’ndeki Yaşam Bilimleri için Searle Liderlik Fonu ve Chicago Biyomedikal Konsorsiyumu tarafından Chicago Community Trust’taki Searle Funds’ın desteğiyle desteklenmiştir. B.W.L., Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) Eğitim Hibe T32GM-008061 tarafından desteklenmiştir.

Materials

(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

References

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).

Play Video

Cite This Article
Banerjee, C., Liauw, B. W., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).

View Video