Visualisation de la dynamique conformationnelle des récepteurs membranaires à l’aide d’une seule molécule FRET
Summary
Cette étude présente une procédure détaillée pour effectuer des expériences de transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) sur des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en utilisant un marquage spécifique au site via l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA). Le protocole fournit un guide étape par étape pour la préparation des échantillons smFRET, les expériences et l’analyse des données.
Abstract
La capacité des cellules à répondre aux signaux externes est essentielle au développement, à la croissance et à la survie cellulaires. Pour répondre à un signal de l’environnement, une cellule doit être capable de le reconnaître et de le traiter. Cette tâche repose principalement sur la fonction des récepteurs membranaires, dont le rôle est de convertir les signaux dans le langage biochimique de la cellule. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines réceptrices membranaires chez l’homme. Parmi les RCPG, les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) sont une sous-classe unique qui fonctionne comme dimères obligatoires et possède un grand domaine extracellulaire qui contient le site de liaison au ligand. Les progrès récents dans les études structurelles des mGluR ont amélioré la compréhension de leur processus d’activation. Cependant, la propagation de changements conformationnels à grande échelle par mGluR pendant l’activation et la modulation est mal comprise. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) est une technique puissante pour visualiser et quantifier la dynamique structurelle des biomolécules au niveau de la protéine unique. Pour visualiser le processus dynamique d’activation de mGluR2, des capteurs conformationnels fluorescents basés sur l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA) ont été développés qui ont permis le marquage des protéines spécifiques au site sans perturbation de la structure native des récepteurs. Le protocole décrit ici explique comment effectuer ces expériences, y compris la nouvelle approche d’étiquetage UAA, la préparation des échantillons et l’acquisition et l’analyse des données smFRET. Ces stratégies sont généralisables et peuvent être étendues pour étudier la dynamique conformationnelle d’une variété de protéines membranaires.
Introduction
Le transfert d’informations à travers la membrane plasmique dépend fortement de la fonction des récepteurs membranaires1. La liaison du ligand à un récepteur entraîne un changement conformationnel et l’activation du récepteur. Ce processus est souvent de nature allostérique2. Avec plus de 800 membres, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires chez l’homme3. En raison de leur rôle dans presque tous les processus cellulaires, les RCPG sont devenus des cibles importantes pour le développement thérapeutique. Dans le modèle canonique de signalisation GPCR, l’activation agoniste entraîne des changements conformationnels du récepteur qui activent ensuite le complexe protéique G hétérotrimérique via l’échange de GDP contre GTP à la poche de liaison nucléotidique de Gα. Les sous-unités Gα-GTP et Gβγ activées contrôlent alors l’activité des protéines effectrices en aval et propagent la cascade de signalisation 4,5. Ce processus de signalisation dépend essentiellement de la capacité des ligands à modifier la forme tridimensionnelle du récepteur. Une compréhension mécaniste de la façon dont les ligands y parviennent est essentielle pour développer de nouvelles thérapies et concevoir des récepteurs et des capteurs synthétiques.
Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) font partie de la famille des RCPG de classe C et sont importants pour les effets neuromodulateurs lents du glutamate et le réglage de l’excitabilité neuronale 6,7. Parmi tous les RCPG, les RCPG de classe C sont structurellement uniques en ce sens qu’ils fonctionnent comme des dimères obligatoires. Les mGluR contiennent trois domaines structuraux : le domaine du piège à mouches de Vénus (VFT), le domaine riche en cystéine (CRD) et le domaine transmembranaire (TMD)8. Les changements conformationnels au cours du processus d’activation sont complexes et impliquent un couplage conformationnel local et global qui se propage sur une distance de 12 nm, ainsi que la coopérativité des dimères. Les conformations intermédiaires, l’ordre temporel des états et le taux de transition entre les états sont inconnus. En suivant la conformation des récepteurs individuels en temps réel, il est possible d’identifier les états intermédiaires transitoires et la séquence des changements conformationnels lors de l’activation. Ceci peut être réalisé en appliquant le transfert d’énergie de résonance de fluorescenceà molécule unique 9,10 (smFRET), comme cela a été récemment appliqué pour visualiser la propagation des changements conformationnels lors de l’activation de mGluR2 11. Une étape clé dans les expériences FRET est la génération de capteurs FRET par insertion spécifique au site des fluorophores donneurs et accepteurs dans la protéine d’intérêt. Une stratégie d’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA) a été adoptée12,13,14,15 pour surmonter les limites des technologies typiques de marquage fluorescent spécifiques au site qui nécessitent la création de mutants sans cystéine ou l’insertion d’une grande étiquette génétiquement codée. Cela a permis d’observer le réarrangement conformationnel de l’essentiel liant allostérique, qui a rejoint les domaines de liaison et de signalisation du ligand de mGluR2. Dans ce protocole, un guide étape par étape pour effectuer des expériences smFRET sur mGluR2 est présenté, y compris l’approche pour le marquage spécifique au site de mGluR2 avec UAA pour fixer des fluorophores en utilisant la réaction de cyclisation de l’azoture catalysée par le cuivre. De plus, ce protocole décrit la méthodologie pour la capture directe des protéines membranaires et l’analyse des données. Le protocole décrit ici est également applicable à l’étude de la dynamique conformationnelle d’autres protéines membranaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les RCPG sont des protéines qui agissent sur la membrane cellulaire pour initier la transduction du signal. De nombreux RCPG se composent de plusieurs domaines, la signalisation dépendant de l’interaction coopérative entre les domaines. Pour moduler les propriétés de ces récepteurs membranaires, il est essentiel de comprendre le comportement dynamique des multiples domaines. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) est une technique de fluorescence qui permet de mesure…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Reza Vafabakhsh pour leurs discussions. Ce travail a été soutenu par la subvention R01GM140272 des National Institutes of Health (à R.V.), par le Searle Leadership Fund for the Life Sciences de la Northwestern University et par le Chicago Biomedical Consortium avec le soutien des Searle Funds du Chicago Community Trust (à R.V.). B.W.L. a été soutenu par la subvention de formation T32GM-008061 du National Institute of General Medical Sciences (NIGMS).
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
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