Summary

Визуализация конформационной динамики мембранных рецепторов с помощью одномолекулярного FRET

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

В этом исследовании представлена подробная процедура проведения экспериментов по переносу энергии одномолекулярного флуоресцентного резонанса (smFRET) на рецепторах, связанных с G-белком (GPCR), с использованием сайт-специфической маркировки через включение неестественных аминокислот (UAA). Протокол содержит пошаговое руководство по подготовке образцов smFRET, экспериментам и анализу данных.

Abstract

Способность клеток реагировать на внешние сигналы имеет важное значение для клеточного развития, роста и выживания. Чтобы реагировать на сигнал из окружающей среды, клетка должна уметь распознавать и обрабатывать его. Эта задача в основном опирается на функцию мембранных рецепторов, роль которых заключается в преобразовании сигналов в биохимический язык клетки. Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), составляют крупнейшее семейство мембранных рецепторных белков у людей. Среди GPCR метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs) являются уникальным подклассом, которые функционируют как облигатные димеры и обладают большим внеклеточным доменом, содержащим лиганд-связывающий сайт. Последние достижения в структурных исследованиях mGluRs улучшили понимание процесса их активации. Однако распространение крупномасштабных конформационных изменений через mGluRs во время активации и модуляции плохо изучено. Одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) является мощным методом визуализации и количественной оценки структурной динамики биомолекул на уровне одного белка. Для визуализации динамического процесса активации mGluR2 были разработаны флуоресцентные конформационные датчики на основе включения неестественных аминокислот (UAA), которые позволили маркировать сайт-специфический белок без возмущения нативной структуры рецепторов. Протокол, описанный здесь, объясняет, как выполнять эти эксперименты, включая новый подход к маркировке UAA, подготовку образцов и сбор и анализ данных smFRET. Эти стратегии являются обобщаемыми и могут быть расширены для исследования конформационной динамики различных мембранных белков.

Introduction

Передача информации через плазматическую мембрану сильно зависит от функции мембранных рецепторов1. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению и активации рецептора. Этот процесс часто носит аллостерический характер2. С более чем 800 членами, рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), являются крупнейшим семейством мембранных рецепторов у людей3. Благодаря своей роли почти во всех клеточных процессах, GPCR стали важными мишенями для терапевтического развития. В канонической модели передачи сигналов GPCR активация агониста приводит к конформационным изменениям рецептора, которые впоследствии активируют гетеротримерный G-белковый комплекс путем обмена GDP на GTP в нуклеотидном карманеG-α. Активированные субъединицы Gα-GTP и Gβγ затем контролируют активность последующих эффекторных белков и распространяют сигнальный каскад 4,5. Этот сигнальный процесс существенно зависит от способности лигандов изменять трехмерную форму рецептора. Механистическое понимание того, как лиганды достигают этого, имеет решающее значение для разработки новых терапевтических средств и проектирования синтетических рецепторов и датчиков.

Метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs) являются членами семейства GPCR класса C и важны для медленных нейромодулирующих эффектов глутамата и настройки возбудимости нейронов 6,7. Среди всех GPCR GPCR класса C являются структурно уникальными в том смысле, что они функционируют как облигатные димеры. mGluRs содержат три структурных домена: домен венериной мухоловки (VFT), богатый цистеином домен (CRD) и трансмембранный домен (TMD)8. Конформационные изменения в процессе активации являются сложными и включают локальную и глобальную конформационную связь, которая распространяется на расстояние 12 нм, а также димерную кооперативность. Промежуточные конформации, временное упорядочение состояний и скорость перехода между состояниями неизвестны. Следуя конформации отдельных рецепторов в режиме реального времени, можно идентифицировать переходные промежуточные состояния и последовательность конформационных изменений во время активации. Это может быть достигнуто путем применения одномолекулярного флуоресцентного резонансного переноса энергии 9,10 (smFRET), как это было недавно применено для визуализации распространения конформационных изменений при активации mGluR211. Ключевым шагом в экспериментах FRET является генерация датчиков FRET путем специфической для сайта вставки донорских и акцепторных флуорофоров в интересующий белок. Стратегия включения неестественных аминокислот (UAA) была принята 12,13,14,15 для преодоления ограничений типичных технологий флуоресцентной маркировки, которые требуют создания мутантов без цистеина или вставки большой генетически закодированной метки. Это позволило наблюдать конформационную перестройку существенного компактного аллостерического линкера, который соединял лигандсвязывающий и сигнальный домены mGluR2. В этом протоколе представлено пошаговое руководство по проведению экспериментов smFRET на mGluR2, включая подход к маркировке mGluR2 с помощью UAA для присоединения флуорофоров с использованием катализируемой медью реакции циклизации азида. Более того, этот протокол описывает методологию прямого захвата мембранных белков и анализа данных. Протокол, изложенный здесь, также применим к изучению конформационной динамики других мембранных белков.

Protocol

Общий рабочий процесс протокола описан на рисунке 1. 1. Подготовка пробоотборной камеры Очистка слайдов и крышекПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги направлены на очистку поверхностей слайдов, а также обшивки и подготовку их к аминосиланизации. Одним из важнейш…

Representative Results

Экспрессия и флуоресцентная маркировка датчика FRET на основе UAAВ настоящем документе обсуждаются примерные результаты введения и флуоресцентной маркировки УАА (АЗП) в crD mGluR2 (548UAA). Как упоминалось ранее, для вставки AZP в mGluR2 необходима коэкспрессия инженерного тр?…

Discussion

GPCR – это белки, которые действуют на клеточную мембрану, чтобы инициировать трансдукцию сигнала. Многие GPCR состоят из нескольких доменов, причем сигнализация зависит от совместного взаимодействия между доменами. Чтобы модулировать свойства этих мембранных рецепторов, важно понять дин…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим членов лаборатории Резы Вафабахша за обсуждения. Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения R01GM140272 (для R.V.), Фондом лидерства Searle для наук о жизни в Северо-Западном университете и Чикагским биомедицинским консорциумом при поддержке фондов Searle в The Chicago Community Trust (для R.V.). B.W.L. был поддержан грантом Национального института общих медицинских наук (NIGMS) T32GM-008061.

Materials

(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

References

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).

Play Video

Cite This Article
Banerjee, C., Liauw, B. W., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).

View Video