IDG-SW3-celkweek in een driedimensionale extracellulaire matrix
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het kweken van IDG-SW3-cellen in een driedimensionale (3D) extracellulaire matrix.
Abstract
Osteocyten worden beschouwd als niet-proliferatieve cellen die terminaal gedifferentieerd zijn van osteoblasten. Osteoblasten ingebed in de extracellulaire matrix van het bot (osteoïde) brengen het Pdpn-gen tot expressie om cellulaire dendrieten te vormen en te transformeren in pre-osteocyten. Later brengen preosteocyten het Dmp1-gen tot expressie om matrixmineralisatie te bevorderen en daardoor te transformeren in volwassen osteocyten. Dit proces wordt osteocytogenese genoemd. IDG-SW3 is een bekende cellijn voor in vitro studies van osteocytogenese. Veel eerdere methoden hebben collageen I gebruikt als het belangrijkste of het enige onderdeel van de kweekmatrix. Naast collageen I bevat de osteoïde echter ook een grondsubstantie, die een belangrijk onderdeel is bij het bevorderen van celgroei, hechting en migratie. Bovendien is de matrixstof transparant, wat de transparantie van de collageen I-gevormde gel verhoogt en zo helpt bij het verkennen van dendrietvorming door middel van beeldvormingstechnieken. Dit artikel beschrijft dus een protocol om een 3D-gel tot stand te brengen met behulp van een extracellulaire matrix samen met collageen I voor IDG-SW3-overleving. In dit werk werden dendrietvorming en genexpressie geanalyseerd tijdens osteocytogenese. Na 7 dagen osteogene kweek werd een uitgebreid dendrietennetwerk duidelijk waargenomen onder een fluorescentie confocale microscoop. Real-time PCR toonde aan dat de mRNA-niveaus van Pdpn en Dmp1 gedurende 3 weken voortdurend toenamen. In week 4 onthulde de stereomicroscoop een ondoorzichtige gel gevuld met minerale deeltjes, in overeenstemming met de röntgenfluorescentie (XRF)-test. Deze resultaten geven aan dat deze kweekmatrix met succes de overgang van osteoblasten naar volwassen osteocyten vergemakkelijkt.
Introduction
Osteocyten zijn terminaal gedifferentieerde cellen die zijn afgeleid van osteoblasten 1,2. Zodra de osteoblast door de osteoïde is begraven, ondergaat deze osteocytogenese en brengt het Pdpn-gen tot expressie om preosteocyten te vormen, het Dmp1-gen om de osteoïde te mineraliseren en de Sost– en Fgf23-genen om te functioneren als een volwassen osteocyt in botweefsel3. Hier wordt een 3D-kweeksysteem geïntroduceerd om dendrietextensie en markergenexpressie in het osteocytogeneseproces te identificeren.
IDG-SW3-cellen zijn een onsterfelijke primaire cellijn afgeleid van transgene muizen en kunnen osteoblasten uitbreiden of repliceren tot late osteocytendifferentiatie wanneer ze in verschillende media worden gekweekt4. Vergeleken met MLO-A5, MLO-Y4 en andere cellijnen is het waarschijnlijker dat het expressieprofiel van functionele eiwitten, het vermogen om calciumzoutafzetting uit te voeren en de reacties op verschillende hormonen in IDG-SW3-cellen hetzelfde zijn als die van primaire osteocyten in het botweefsel4.
In vergelijking met 2D-systemen zijn 3D-kweeksystemen beter in staat om de in vivo cellulaire groeiomgeving na te bootsen, inclusief de nutriëntengradiënt, de lage mechanische stijfheid en het omringende mechanische bereik (tabel 1). De meeste van de voorgaande methoden voor het kweken van osteoblastische cellen in een 3D-systeem gebruikten collageen I als de unieke component in formuleringen 4,5,6, omdat collageen I-vezels dienen als de plaats van calcium- en fosforafzetting. Een onmisbaar bestanddeel in de osteoïde, de extracellulaire matrix, bevat echter een grote groep cellulaire factoren die cellulaire groei, adhesie en migratie bevorderen 7,8 en is transparant en handig voor beeldvormingsobservatie. Dit protocol gebruikt dus Matrigel (hierna te noemen basale membraanmatrix) als secundaire component voor de osteocytogenesestudie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een kritiek punt in dit protocol is dat stap 1 en stap 2 op ijs moeten worden uitgevoerd om spontane stolling te voorkomen. Bij deze methode was de uiteindelijke concentratie collageen I 1,2 mg/ml. Er moet dus een optimaal ddH2O-volume worden berekend om overeen te komen met de verschillende collagenen van verschillende fabrikanten.
In vivo omvat osteocytogenese een polaire beweging van osteoblasten van het oppervlak naar het binnenste van trabeculair bot1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. Lynda F. Bonewald voor het schenken van de IDG-SW3-cellijn. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82070902, 82100935 en 81700778) en het Shanghai “Science and Technology Innovation” Sailing Project (21YF1442000).
Materials
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell … and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).
- Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
- Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
- Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
- Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
- Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
- Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).
