IDG-SW3 Üç Boyutlu Hücre Dışı Matriste Hücre Kültürü
Summary
Burada, IDG-SW3 hücrelerini üç boyutlu (3D) hücre dışı bir matriste kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Osteositler, osteoblastlardan terminal olarak farklılaşan proliferatif olmayan hücreler olarak kabul edilir. Kemik hücre dışı matrikste (osteoid) gömülü osteoblastlar, hücresel dendritler oluşturmak ve preosteositlere dönüşmek için Pdpn genini eksprese eder. Daha sonra, preosteositler, matriks mineralizasyonunu teşvik etmek ve böylece olgun osteositlere dönüşmek için Dmp1 genini eksprese eder. Bu sürece osteositogenez denir. IDG-SW3, osteositogenezin in vitro çalışmaları için iyi bilinen bir hücre hattıdır. Önceki birçok yöntem, kollajen I’i kültür matrisinin ana veya tek bileşeni olarak kullanmıştır. Bununla birlikte, kollajen I’e ek olarak, osteoid ayrıca hücresel büyümeyi, yapışmayı ve göçü teşvik etmede önemli bir bileşen olan bir öğütülmüş madde içerir. Ek olarak, matris maddesi şeffaftır, bu da kollajen I-oluşturulan jelin şeffaflığını arttırır ve böylece görüntüleme teknikleri yoluyla dendrit oluşumunun araştırılmasına yardımcı olur. Bu nedenle, bu makale, IDG-SW3’ün hayatta kalması için kollajen I ile birlikte hücre dışı bir matris kullanarak bir 3D jel oluşturmak için bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu çalışmada, osteositogenez sırasında dendrit oluşumu ve gen ekspresyonu analiz edilmiştir. 7 günlük osteojenik kültürden sonra, floresan konfokal mikroskop altında geniş bir dendrit ağı açıkça gözlendi. Gerçek zamanlı PCR, Pdpn ve Dmp1’in mRNA seviyelerinin 3 hafta boyunca sürekli arttığını gösterdi. 4. haftada, stereomikroskop, X-ışını floresan (XRF) testi ile tutarlı olarak mineral parçacıklarla dolu opak bir jel ortaya çıkardı. Bu sonuçlar, bu kültür matrisinin osteoblastlardan olgun osteositlere geçişi başarılı bir şekilde kolaylaştırdığını göstermektedir.
Introduction
Osteositler, osteoblastlardan(1,2) türetilen terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir. Osteoblast osteoid tarafından gömüldükten sonra, osteositogeneze uğrar ve preosteositler oluşturmak için Pdpn genini, osteoidi mineralize etmek için Dmp1 genini ve kemik dokusunda olgun bir osteosit olarak işlev görmek için Sost ve Fgf23 genlerini eksprese eder3. Burada, osteositogenez sürecinde dendrit uzantısını ve işaretleyici gen ekspresyonunu tanımlamak için bir 3D kültür sistemi tanıtılmıştır.
IDG-SW3 hücreleri, transgenik farelerden türetilen ölümsüzleştirilmiş bir birincil hücre hattıdır ve farklı ortamlarda kültürlendiğinde osteoblastı geç osteosit farklılaşmasına kadar genişletebilir veya çoğaltabilir4. MLO-A5, MLO-Y4 ve diğer hücre dizileri ile karşılaştırıldığında, fonksiyonel proteinlerin ekspresyon profili, kalsiyum tuzu biriktirme yeteneği ve IDG-SW3 hücrelerindeki çeşitli hormonlara verilen yanıtların, kemik dokusundaki primer osteositlerinkilerle aynı olma olasılığı daha yüksektir4.
2D sistemlerle karşılaştırıldığında, 3D kültür sistemleri, besin gradyanı, düşük mekanik sertlik ve çevreleyen mekanik aralık dahil olmak üzere in vivo hücresel büyüme ortamını taklit etme konusunda daha yeteneklidir (Tablo 1). Osteoblastik hücrelerin bir 3D sistemde kültürlenmesi için önceki yöntemlerin çoğu, 4,5,6 formülasyonlarında benzersiz bileşen olarak kollajen I’i kullandı, çünkü kollajen I lifleri kalsiyum ve fosfor birikimi bölgesi olarak hizmet eder. Bununla birlikte, osteoidde vazgeçilmez bir bileşen olan hücre dışı matriks, hücresel büyümeyi, yapışmayı ve göçü 7,8 destekleyen geniş bir hücresel faktör grubu içerir ve görüntüleme gözlemi için şeffaf ve uygundur. Bu nedenle, bu protokol, osteositogenez çalışması için ikincil bir bileşen olarak Matrigel’i (bundan sonra bazal membran matrisi olarak anılacaktır) kullanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokoldeki kritik bir nokta, spontan pıhtılaşmayı önlemek için 1. ve 2. adımların buz üzerinde gerçekleştirilmesi gerektiğidir. Bu yöntemde, nihai kollajen I konsantrasyonu 1.2 mg / mL idi. Bu nedenle, çeşitli üreticilerin farklı kollajenlerine uyacak şekilde optimal bir ddH2O hacmi hesaplanmalıdır.
İn vivo osteositogenez, osteoblastların yüzeyden trabeküler kemiğiniçine polar hareketini içerir 14. Bu protokol, hücrel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IDG-SW3 hücre hattını hediye ettiği için Dr. Lynda F. Bonewald’a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82070902, 82100935 ve 81700778) ve Şangay “Bilim ve Teknoloji İnovasyonu” Yelken Projesi (21YF1442000) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell … and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).
- Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
- Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
- Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
- Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
- Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
- Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).
