Colture cellulari IDG-SW3 in una matrice extracellulare tridimensionale

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la coltura di cellule IDG-SW3 in una matrice extracellulare tridimensionale (3D).

Abstract

Gli osteociti sono considerati cellule non proliferative che si differenziano terminalmente dagli osteoblasti. Gli osteoblasti incorporati nella matrice extracellulare ossea (osteoide) esprimono il gene Pdpn per formare dendriti cellulari e trasformarsi in preosteociti. Successivamente, i preosteociti esprimono il gene Dmp1 per promuovere la mineralizzazione della matrice e quindi trasformarsi in osteociti maturi. Questo processo è chiamato osteocitogenesi. IDG-SW3 è una linea cellulare ben nota per studi in vitro sull’osteocitogenesi. Molti metodi precedenti hanno utilizzato il collagene I come componente principale o unico della matrice di coltura. Tuttavia, oltre al collagene I, l’osteoide contiene anche una sostanza di base, che è un componente importante nel promuovere la crescita, l’adesione e la migrazione cellulare. Inoltre, la sostanza della matrice è trasparente, il che aumenta la trasparenza del gel di collagene formato da I e, quindi, aiuta l’esplorazione della formazione di dendriti attraverso tecniche di imaging. Pertanto, questo documento descrive in dettaglio un protocollo per stabilire un gel 3D utilizzando una matrice extracellulare insieme al collagene I per la sopravvivenza di IDG-SW3. In questo lavoro, la formazione dei dendriti e l’espressione genica sono state analizzate durante l’osteocitogenesi. Dopo 7 giorni di coltura osteogenica, un’estesa rete di dendriti è stata chiaramente osservata al microscopio confocale a fluorescenza. La PCR in tempo reale ha mostrato che i livelli di mRNA di Pdpn e Dmp1 sono aumentati continuamente per 3 settimane. Alla settimana 4, lo stereomicroscopio ha rivelato un gel opaco pieno di particelle minerali, coerente con il test di fluorescenza a raggi X (XRF). Questi risultati indicano che questa matrice di coltura facilita con successo la transizione dagli osteoblasti agli osteociti maturi.

Introduction

Gli osteociti sono cellule terminalmente differenziate derivate dagli osteoblasti ^1,2. Una volta che l’osteoblasto è sepolto dall’osteoide, subisce osteocitogenesi ed esprime il gene Pdpn per formare i preosteociti, il gene Dmp1 per ^{mineralizzare l’osteoide e i} geni Sost e Fgf23 per funzionare come un osteocita maturo nel tessuto osseo³. Qui, viene introdotto un sistema di coltura 3D per identificare l’estensione dei dendriti e l’espressione genica dei marcatori nel processo di osteocitogenesi.

Le cellule IDG-SW3 sono una linea cellulare primaria immortalizzata derivata da topi transgenici e possono espandere o replicare l’osteoblasto alla differenziazione tardiva degli osteociti quando coltivate in terreni diversi⁴. Rispetto a MLO-A5, MLO-Y4 e altre linee cellulari, il profilo di espressione delle proteine funzionali, la capacità di eseguire la deposizione di sali di calcio e le risposte a vari ormoni nelle cellule IDG-SW3 hanno maggiori probabilità di essere le stesse di quelle degli osteociti primari nel tessuto osseo⁴.

Rispetto ai sistemi 2D, i sistemi di coltura 3D sono più in grado di imitare l’ambiente di crescita cellulare in vivo, compreso il gradiente di nutrienti, la bassa rigidità meccanica e l’intervallo meccanico circostante (Tabella 1). La maggior parte dei metodi precedenti per la coltura di cellule osteoblastiche in un sistema 3D utilizzava il collagene I come componente unico nelle formulazioni ^4,5,6, perché le fibre di collagene I fungono da sito di deposizione di calcio e fosforo. Tuttavia, un costituente indispensabile nell’osteoide, la matrice extracellulare, contiene un ampio gruppo di fattori cellulari che promuovono la crescita, l’adesione e la migrazione cellulare ^7,8 ed è trasparente e conveniente per l’osservazione di imaging. Pertanto, questo protocollo utilizza Matrigel (di seguito denominato matrice di membrana basale) come componente secondario per lo studio dell’osteocitogenesi.

Protocol

Questo protocollo è adatto per la coltura di cellule in quattro pozzetti di piastre da 24 pozzetti. Se si preparano più campioni o piastre, le quantità dei reagenti devono essere aumentate di conseguenza. 1. Preparazione della miscela di collagene I NOTA: Il collagene I e la matrice della membrana basale gelificano rapidamente a temperatura ambiente. Pertanto, il collagene deve essere maneggiato con ghiaccio (da 2 °C a 8 °C). Tutti i puntali e le…

Representative Results

Dopo la colorazione delle cellule vive/morte, le cellule sono state visualizzate utilizzando un microscopio laser confocale. Tutte le cellule erano calceina AM-positiva (colore verde) e non c’erano quasi cellule EthD-1-positive (colore rosso) nel campo, indicando che il sistema di gel realizzato con questo metodo è altamente adatto per l’osteocitogenesi (Figura 1A, a sinistra). Per determinare meglio la distribuzione spaziale delle cellule, è stata scelta un’immagine pseudocolorata per vis…

Discussion

Un punto critico di questo protocollo è che le fasi 1 e 2 devono essere eseguite su ghiaccio per prevenire la coagulazione spontanea. In questo metodo, la concentrazione finale di collagene I era di 1,2 mg/mL. Pertanto, è necessario calcolare un volume ottimale di ddH₂O per abbinare i diversi collageni di vari produttori.

In vivo, l’osteocitogenesi comporta un movimento polare degli osteoblasti dalla superficie all’interno dell’osso trabecolare¹⁴. …

Materials

0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422