Cultivo de Células IDG-SW3 em Matriz Tridimensional Extracelular

Summary

Apresentamos aqui um protocolo para cultivo de células IDG-SW3 em uma matriz extracelular tridimensional (3D).

Abstract

Os osteócitos são considerados células não proliferativas que se diferenciam terminalmente dos osteoblastos. Osteoblastos embutidos na matriz extracelular óssea (osteóide) expressam o gene Pdpn para formar dendritos celulares e transformar-se em preosteócitos. Posteriormente, os pré-osteócitos expressam o gene Dmp1 para promover a mineralização da matriz e, assim, transformar-se em osteócitos maduros. Esse processo é chamado de osteocitogênese. IDG-SW3 é uma linhagem celular bem conhecida para estudos in vitro de osteocitogênese. Muitos métodos anteriores utilizaram o colágeno I como principal ou único componente da matriz de cultivo. No entanto, além do colágeno I, o osteóide também contém uma substância fundamental, que é um componente importante na promoção do crescimento, adesão e migração celular. Além disso, a substância da matriz é transparente, o que aumenta a transparência do gel formado pelo colágeno I e, assim, auxilia a exploração da formação de dendritos por meio de técnicas de imagem. Assim, este trabalho detalha um protocolo para estabelecer um gel 3D usando uma matriz extracelular juntamente com colágeno I para a sobrevivência do IDG-SW3. Neste trabalho, a formação de dendritos e a expressão gênica foram analisadas durante a osteocitogênese. Após 7 dias de cultura osteogênica, uma extensa rede dendrítica foi claramente observada sob microscópio confocal de fluorescência. A PCR em tempo real mostrou que os níveis de RNAm de Pdpn e Dmp1 aumentaram continuamente por 3 semanas. Na semana 4, o estereomicroscópio revelou um gel opaco preenchido com partículas minerais, consistente com o ensaio de fluorescência de raios X (XRF). Estes resultados indicam que esta matriz de cultura facilita com sucesso a transição de osteoblastos para osteócitos maduros.

Introduction

Os osteócitos são células terminalmente diferenciadas derivadas dos^{osteoblastos1,2}. Uma vez sepultado pelo osteóide, o osteoblasto sofre osteocitogênese e expressa o gene Pdpn para formar preosteócitos, o gene Dmp1 para ^{mineralizar o osteóide e os} genes Sost e Fgf23 para funcionar como osteócito maduro no tecido ósseo3. Aqui, um sistema de cultura 3D é introduzido para identificar a extensão dos dendritos e a expressão gênica de marcadores no processo de osteocitogênese.

As células IDG-SW3 são uma linhagem celular primária imortalizada derivada de camundongos transgênicos e podem expandir ou replicar osteoblastos para diferenciação tardia de osteócitos quando cultivadas em diferentes^meios4. Em comparação com MLO-A5, MLO-Y4 e outras linhagens celulares, o perfil de expressão de proteínas funcionais, a capacidade de realizar deposição de sal de cálcio e as respostas a vários hormônios em células IDG-SW3 são mais prováveis de serem as mesmas que as de osteócitos primários no tecido^ósseo4.

Comparados aos sistemas 2D, os sistemas de cultivo 3D são mais capazes de mimetizar o ambiente de crescimento celular in vivo, incluindo o gradiente de nutrientes, baixa rigidez mecânica e faixa mecânica circundante (Tabela 1). A maioria dos métodos anteriores de cultivo de células osteoblásticas em sistema 3D utilizava o colágeno I como único componente nas formulações ^4,5,6, pois as fibras colágenas I servem como local de deposição de cálcio e fósforo. Entretanto, um constituinte indispensável no osteóide, a matriz extracelular, contém um grande grupo de fatores celulares que promovem o crescimento, adesão e migração^celular7,8 e é transparente e conveniente para a observação por imagem. Assim, este protocolo utiliza o Matrigel (doravante denominado matriz de membrana basal) como componente secundário para o estudo da osteocitogênese.

Protocol

Este protocolo é adequado para o cultivo de células em quatro poços de placas de 24 poços. Se preparar várias amostras ou placas, as quantidades dos reagentes devem ser aumentadas em conformidade. 1. Preparação da mistura de colágeno I NOTA: Colágeno I e gel de matriz de membrana basal rapidamente à temperatura ambiente. Portanto, o colágeno deve ser manipulado no gelo (2 °C a 8 °C). Todas as pontas e tubos utilizados devem ser pré-refri…

Representative Results

Após a coloração de células vivas/mortas, as células foram visualizadas em microscópio confocal a laser. Todas as células eram positivas para calceína AM (cor verde) e quase não havia células positivas para EthD-1 (cor vermelha) no campo, indicando que o sistema de gel feito por este método é altamente adequado para osteocitogênese (Figura 1A, esquerda). Para melhor determinar a distribuição espacial das células, uma imagem pseudocolorida foi escolhida para exibir os dendrito…

Discussion

Um ponto crítico nesse protocolo é que as etapas 1 e 2 devem ser realizadas em gelo para evitar coagulação espontânea. Nesse método, a concentração final de colágeno I foi de 1,2 mg/mL. Assim, um volume ótimo de ddH₂O deve ser calculado para corresponder aos diferentes colágenos de vários fabricantes.

In vivo, a osteocitogênese envolve um movimento polar de osteoblastos da superfície para o interior do osso trabecular14. Este protocolo …

Materials

0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422