Cultivo celular IDG-SW3 en matriz extracelular tridimensional

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de células IDG-SW3 en una matriz extracelular tridimensional (3D).

Abstract

Se considera que los osteocitos son células no proliferativas que se diferencian terminalmente de los osteoblastos. Los osteoblastos incrustados en la matriz extracelular ósea (osteoide) expresan el gen Pdpn para formar dendritas celulares y transformarse en preosteocitos. Más tarde, los preosteocitos expresan el gen Dmp1 para promover la mineralización de la matriz y, por lo tanto, transformarse en osteocitos maduros. Este proceso se denomina osteocitogénesis. IDG-SW3 es una línea celular bien conocida para estudios in vitro de osteocitogénesis. Muchos métodos anteriores han utilizado colágeno I como el componente principal o único de la matriz de cultivo. Sin embargo, además del colágeno I, el osteoide también contiene una sustancia fundamental, que es un componente importante para promover el crecimiento, la adhesión y la migración celular. Además, la sustancia de la matriz es transparente, lo que aumenta la transparencia del gel formado por colágeno I y, por lo tanto, ayuda a la exploración de la formación de dendritas a través de técnicas de imagen. Así, en este trabajo se detalla un protocolo para establecer un gel 3D utilizando una matriz extracelular junto con colágeno I para la supervivencia de IDG-SW3. En este trabajo se analizó la formación de dendritas y la expresión génica durante la osteocitogénesis. Después de 7 días de cultivo osteogénico, se observó claramente una extensa red de dendritas bajo un microscopio confocal de fluorescencia. La PCR en tiempo real mostró que los niveles de ARNm de Pdpn y Dmp1 aumentaron continuamente durante 3 semanas. En la semana 4, el microscopio estereoscópico reveló un gel opaco lleno de partículas minerales, consistente con el ensayo de fluorescencia de rayos X (XRF). Estos resultados indican que esta matriz de cultivo facilita con éxito la transición de osteoblastos a osteocitos maduros.

Introduction

Los osteocitos son células terminalmente diferenciadas derivadas de osteoblastos ^1,2. Una vez que el osteoblasto es enterrado por el osteoide, se somete a osteocitogénesis y expresa el gen Pdpn para formar preosteocitos, el gen Dmp1 para ^{mineralizar el osteoide y los} genes Sost y Fgf23 para funcionar como un osteocito maduro en el tejido óseo³. Aquí, se introduce un sistema de cultivo 3D para identificar la extensión de las dendritas y la expresión génica de marcadores en el proceso de osteocitogénesis.

Las células IDG-SW3 son una línea celular primaria inmortalizada derivada de ratones transgénicos y pueden expandirse o replicarse osteoblastos a la diferenciación tardía de osteocitos cuando se cultivan en diferentes medios⁴. En comparación con MLO-A5, MLO-Y4 y otras líneas celulares, es más probable que el perfil de expresión de las proteínas funcionales, la capacidad de realizar la deposición de sales de calcio y las respuestas a diversas hormonas en las células IDG-SW3 sean las mismas que las de los osteocitos primarios en el tejido óseo⁴.

En comparación con los sistemas 2D, los sistemas de cultivo 3D son más capaces de imitar el entorno de crecimiento celular in vivo, incluido el gradiente de nutrientes, la baja rigidez mecánica y el rango mecánico circundante (Tabla 1). La mayoría de los métodos anteriores para cultivar células osteoblásticas en un sistema 3D utilizaban colágeno I como componente único en las formulaciones ^4,5,6, porque las fibras de colágeno I sirven como sitio de deposición de calcio y fósforo. Sin embargo, un constituyente indispensable en el osteoide, la matriz extracelular, contiene un gran grupo de factores celulares que promueven el crecimiento, la adhesión y la migración celular ^7,8 y es transparente y conveniente para la observación por imágenes. Por lo tanto, este protocolo utiliza Matrigel (en adelante, matriz de membrana basal) como componente secundario para el estudio de osteocitogénesis.

Protocol

Este protocolo es adecuado para el cultivo de células en cuatro pocillos de placas de 24 pocillos. Si se preparan varias muestras o placas, las cantidades de los reactivos deben aumentarse en consecuencia. 1. Preparación de la mezcla de colágeno I NOTA: El colágeno I y la matriz de la membrana basal se gelifican rápidamente a temperatura ambiente. Por lo tanto, el colágeno debe manipularse en hielo (2 °C a 8 °C). Todas las puntas y tubos utili…

Representative Results

Después de la tinción de células vivas/muertas, las células se visualizaron utilizando un microscopio láser confocal. Todas las células eran calceína AM positivas (color verde), y casi no había células EthD-1 positivas (color rojo) en el campo, lo que indica que el sistema de gel producido por este método es altamente adecuado para la osteocitogénesis (Figura 1A, izquierda). Para determinar mejor la distribución espacial de las células, se eligió una imagen en pseudocolor para …

Discussion

Un punto crítico en este protocolo es que los pasos 1 y 2 deben realizarse en hielo para evitar la coagulación espontánea. En este método, la concentración final de colágeno I fue de 1,2 mg/mL. Por lo tanto, se debe calcular un volumen óptimo de ddH₂O para que coincida con los diferentes colágenos de varios fabricantes.

In vivo, la osteocitogénesis implica un movimiento polar de los osteoblastos desde la superficie hacia el interior del hueso trabecular<sup class="…

Materials

0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422