IDG-SW3-cellekultur i en tredimensionel ekstracellulær matrix

Summary

Her præsenterer vi en protokol til dyrkning af IDG-SW3-celler i en tredimensionel (3D) ekstracellulær matrix.

Abstract

Osteocytter anses for at være ikke-proliferative celler, der er terminalt differentieret fra osteoblaster. Osteoblaster indlejret i knogleekstracellulær matrix (osteoid) udtrykker Pdpn-genet til dannelse af cellulære dendritter og omdannes til preosteocytter. Senere udtrykker preosteocytter Dmp1-genet for at fremme matrixmineralisering og derved omdanne til modne osteocytter. Denne proces kaldes osteocytogenese. IDG-SW3 er en velkendt cellelinje til in vitro-undersøgelser af osteocytogenese. Mange tidligere metoder har brugt kollagen I som hoved- eller den eneste komponent i dyrkningsmatrixen. Ud over kollagen I indeholder osteoidet imidlertid også et grundstof, som er en vigtig komponent i at fremme cellulær vækst, vedhæftning og migration. Derudover er matrixsubstansen gennemsigtig, hvilket øger gennemsigtigheden af den kollagen I-formede gel og hjælper således udforskningen af dendritdannelse gennem billeddannelsesteknikker. Således beskriver dette papir en protokol til etablering af en 3D-gel ved hjælp af en ekstracellulær matrix sammen med kollagen I til IDG-SW3-overlevelse. I dette arbejde blev dendritdannelse og genekspression analyseret under osteocytogenese. Efter 7 dages osteogen kultur blev et omfattende dendritnetværk tydeligt observeret under et fluorescenskonfokalmikroskop. PCR i realtid viste, at mRNA-niveauerne af Pdpn og Dmp1 kontinuerligt steg i 3 uger. I uge 4 afslørede stereomikroskopet en uigennemsigtig gel fyldt med mineralpartikler, i overensstemmelse med røntgenfluorescensanalysen (XRF). Disse resultater indikerer, at denne kulturmatrix med succes letter overgangen fra osteoblaster til modne osteocytter.

Introduction

Osteocytter er terminalt differentierede celler afledt af osteoblaster ^1,2. Når osteoblasten er begravet af osteoiden, gennemgår den osteocytogenese og udtrykker Pdpn-genet til dannelse af preosteocytter, Dmp1-genet^{til mineralisering af osteoiden} og Sost– og Fgf23-generne til at fungere som en moden osteocyt i knoglevæv³. Her introduceres et 3D-dyrkningssystem til at identificere dendritforlængelse og markørgenekspression i osteocytogeneseprocessen.

IDG-SW3-celler er en udødeliggjort primær cellelinje afledt af transgene mus og kan udvide eller replikere osteoblast til sen osteocytdifferentiering, når de dyrkes i forskellige medier⁴. Sammenlignet med MLO-A5, MLO-Y4 og andre cellelinjer er ekspressionsprofilen for funktionelle proteiner, evnen til at udføre calciumsaltaflejring og reaktionerne på forskellige hormoner i IDG-SW3-celler mere tilbøjelige til at være de samme som for primære osteocytter i knoglevævet⁴.

Sammenlignet med 2D-systemer er 3D-dyrkningssystemer mere i stand til at efterligne in vivo-cellulært vækstmiljø, herunder næringsgradienten, lav mekanisk stivhed og omgivende mekanisk rækkevidde (tabel 1). De fleste af de tidligere metoder til dyrkning af osteoblastiske celler i et 3D-system brugte kollagen I som den unikke komponent i formulering ^4,5,6, fordi kollagen I-fibre tjener som stedet for calcium- og fosforaflejring. Imidlertid indeholder en uundværlig bestanddel i osteoiden, den ekstracellulære matrix, en stor gruppe cellulære faktorer, der fremmer cellulær vækst, vedhæftning og migration ^7,8 og er gennemsigtig og praktisk til billeddannelsesobservation. Denne protokol anvender således Matrigel (i det følgende benævnt kældermembranmatrix) som en sekundær komponent til osteocytogeneseundersøgelsen.

Protocol

Denne protokol er egnet til dyrkning af celler i fire brønde med 24-brøndplader. Ved tilberedning af flere prøver eller plader bør mængden af reagenser øges tilsvarende. 1. Fremstilling af kollagen I-blandingen BEMÆRK: Kollagen I og kældermembranmatrixgel hurtigt ved stuetemperatur. Derfor bør kollagen håndteres på is (2 °C til 8 °C). Alle anvendte spidser og rør skal forkøles, medmindre andet er angivet. Alle procedurer skal udføres i…

Representative Results

Efter levende / døde cellefarvning blev cellerne visualiseret ved hjælp af et konfokal lasermikroskop. Alle cellerne var calcein AM-positive (grøn farve), og der var næsten ingen EthD-1-positive celler (rød farve) i marken, hvilket indikerer, at gelsystemet fremstillet ved denne metode er yderst velegnet til osteocytogenese (figur 1A, venstre). For bedre at bestemme cellernes rumlige fordeling blev der valgt et pseudofarvebillede til at vise celledendritterne på forskellige dybder af g…

Discussion

Et kritisk punkt i denne protokol er, at trin 1 og trin 2 skal udføres på is for at forhindre spontan koagulation. I denne metode var den endelige koncentration af kollagen I 1,2 mg/ml. Således bør et optimalt ddH_2O-volumenberegnes for at matche de forskellige kollagener fra forskellige producenter.

In vivo involverer osteocytogenese en polær bevægelse af osteoblaster fra overfladen til det indre af trabekulær knogle¹⁴. Denne protokol frigør …

Materials

0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422