Nous présentons ici un protocole de culture de cellules IDG-SW3 dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle (3D).
Les ostéocytes sont considérés comme des cellules non prolifératives qui se différencient de manière terminale des ostéoblastes. Les ostéoblastes intégrés dans la matrice extracellulaire osseuse (ostéoïde) expriment le gène Pdpn pour former des dendrites cellulaires et se transformer en préostéocytes. Plus tard, les préostéocytes expriment le gène Dmp1 pour favoriser la minéralisation de la matrice et ainsi se transformer en ostéocytes matures. Ce processus s’appelle l’ostéocytogenèse. IDG-SW3 est une lignée cellulaire bien connue pour les études in vitro de l’ostéocytogenèse. De nombreuses méthodes précédentes ont utilisé le collagène I comme composant principal ou unique de la matrice de culture. Cependant, en plus du collagène I, l’ostéoïde contient également une substance fondamentale, qui est un élément important pour favoriser la croissance, l’adhésion et la migration cellulaires. De plus, la substance matricielle est transparente, ce qui augmente la transparence du gel de collagène formé en I et, ainsi, facilite l’exploration de la formation de dendrites grâce à des techniques d’imagerie. Ainsi, cet article détaille un protocole pour établir un gel 3D utilisant une matrice extracellulaire avec du collagène I pour la survie d’IDG-SW3. Dans ce travail, la formation des dendrites et l’expression des gènes ont été analysées au cours de l’ostéocytogenèse. Après 7 jours de culture ostéogénique, un vaste réseau de dendrites a été clairement observé au microscope confocal à fluorescence. La PCR en temps réel a montré que les niveaux d’ARNm de Pdpn et Dmp1 ont continuellement augmenté pendant 3 semaines. À la semaine 4, le stéréomicroscope a révélé un gel opaque rempli de particules minérales, ce qui correspond au test de fluorescence X (XRF). Ces résultats indiquent que cette matrice de culture facilite avec succès la transition des ostéoblastes vers les ostéocytes matures.
Les ostéocytes sont des cellules différenciées en phase terminale dérivées d’ostéoblastes 1,2. Une fois que l’ostéoblaste est enterré par l’ostéoïde, il subit une ostéocytogenèse et exprime le gène Pdpn pour former des préostéocytes, le gène Dmp1 pour minéraliser l’ostéoïde, et les gènes Sost et Fgf23 pour fonctionner comme un ostéocyte mature dans le tissu osseux3. Ici, un système de culture 3D est introduit pour identifier l’extension de la dendrite et l’expression des gènes marqueurs dans le processus d’ostéocytogenèse.
Les cellules IDG-SW3 sont une lignée cellulaire primaire immortalisée dérivée de souris transgéniques et peuvent étendre ou répliquer l’ostéoblaste à la différenciation tardive des ostéocytes lorsqu’elles sont cultivées dans différents milieux4. Par rapport à MLO-A5, MLO-Y4 et à d’autres lignées cellulaires, le profil d’expression des protéines fonctionnelles, la capacité à effectuer un dépôt de sels de calcium et les réponses à diverses hormones dans les cellules IDG-SW3 sont plus susceptibles d’être les mêmes que celles des ostéocytes primaires dans le tissu osseux4.
Par rapport aux systèmes 2D, les systèmes de culture 3D sont plus capables d’imiter l’environnement de croissance cellulaire in vivo, y compris le gradient de nutriments, la faible rigidité mécanique et la plage mécanique environnante (tableau 1). La plupart des méthodes précédentes de culture de cellules ostéoblastiques dans un système 3D utilisaient le collagène I comme composant unique dans les formulations 4,5,6, car les fibres de collagène I servent de site de dépôt de calcium et de phosphore. Cependant, un constituant indispensable de l’ostéoïde, la matrice extracellulaire, contient un grand groupe de facteurs cellulaires qui favorisent la croissance, l’adhésion et la migration cellulaires 7,8 et est transparent et pratique pour l’observation par imagerie. Ainsi, ce protocole utilise le Matrigel (ci-après dénommé matrice membranaire basale) comme composant secondaire pour l’étude de l’ostéocytogenèse.
Un point critique de ce protocole est que les étapes 1 et 2 doivent être effectuées sur de la glace pour éviter la coagulation spontanée. Dans cette méthode, la concentration finale de collagène I était de 1,2 mg/mL. Ainsi, un volume optimal de ddH2O doit être calculé pour correspondre aux différents collagènes de différents fabricants.
In vivo, l’ostéocytogenèse implique un mouvement polaire des ostéoblastes de la surface vers l’intérieur de l’os tra…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions la Dre Lynda F. Bonewald d’avoir fait don de la lignée cellulaire IDG-SW3. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82070902, 82100935 et 81700778) et le projet de voile « Science and Technology Innovation » de Shanghai (21YF1442000).
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |