Анализ индуцированного Т-клеточными рецепторами притока кальция в первичных мышиных Т-клетках методом проточной цитометрии полного спектра
Summary
Приток кальция, мера передачи сигналов Т-клеток, является эффективным способом анализа ответов на стимуляцию Т-клеточных рецепторов. Этот протокол мультиплексирования Indo-1 с панелями антител, направленными на молекулы клеточной поверхности, использует преимущества очень гибких возможностей проточной цитометрии полного спектра.
Abstract
Приток кальция в ответ на стимуляцию Т-клеточных рецепторов является общей мерой передачи сигналов Т-клеток. Было разработано несколько индикаторных красителей кальция для оценки передачи сигналов кальция с помощью полосовой проточной цитометрии. Этот протокол предназначен для измерения кальциевых реакций в первичных мышиных Т-клетках с использованием проточной цитометрии полного спектра. Общие спленоциты помечаются ратиометрическим индикаторным красителем кальция Indo-1 вместе с панелью флуорохром-конъюгированных антител к молекулам клеточной поверхности. Использование возможностей проточной цитометрии полного спектра обеспечивает платформу для использования широкого спектра окрашиваний клеточной поверхности в сочетании с Indo-1. Затем клетки анализируются в режиме реального времени при 37 ° C до и после добавления антитела против CD3 для стимуляции Т-клеточного рецептора. После смешивания спектральных сигналов рассчитывается отношение связанного с кальцием и свободного кальция Indo-1, которое может быть визуализировано с течением времени для каждой закрытой популяции спленоцитов. Этот метод может позволить проводить одновременный анализ кальциевых реакций в нескольких клеточных популяциях.
Introduction
Индуцированный Т-клеточным рецептором (TCR) приток кальция является полезной мерой активации Т-клеток и часто используется для определения того, имеет ли популяция Т-клеток нарушенные ответы на проксимальных этапах сигнального путиTCR 1. Измерения притока кальция обычно выполняются путем предварительной маркировки Т-клеток одним или парой флуоресцентных индикаторных красителей кальция, а затем изучения флуоресцентных сигналов с использованием проточной цитометрии в режиме реального времени после сшивания TCR 2,3,4. Индо-1, соотношение-метрический краситель кальция, возбуждается УФ-лазером с пиковым излучением на двух разных длинах волн, зависящих от связываниякальция 5, и является широко используемым индикаторным красителем для анализа проточной цитометрии кальциевых реакций в живых лимфоцитах. Поскольку эмиссионный профиль Indo-1 довольно широк, может быть сложно совместить оценку Indo-1 с одновременным анализом нескольких маркеров клеточной поверхности с помощью полосовой проточной цитометрии. Это ограничение ограничивает использование проточного цитометрического анализа кальциевых ответов для предварительно очищенных популяций Т-клеток или для популяций, идентифицированных ограниченным набором молекул клеточной поверхности.
Чтобы устранить ограничения измерения кальциевых реакций на гетерогенных популяциях первичных лимфоцитов с использованием полосовой проточной цитометрии, был разработан протокол для измерения флуоресценции Indo-1 с использованием проточной цитометрии полного спектра. Этот метод позволяет мультиплексировать Indo-1 с панелями антител, направленными на молекулы клеточной поверхности, используя преимущества очень гибких возможностей проточной цитометрии полного спектра. Преимущество использования проточной цитометрии полного спектра по сравнению с обычной проточной цитометрией заключается в ее способности отличать флуоресцентные сигналы от сильно перекрывающихся красителей, тем самым увеличивая количество поверхностных маркеров, которые могут быть одновременно оценены в каждом образце. Традиционная проточная цитометрия использует полосовые фильтры и ограничена одним флуорохромом на детекторную систему6. Проточная цитометрия полного спектра собирает сигналы по всему спектру флуорохрома с помощью 64 детекторов на пятилазерной спектральной проточной цитометрической системе 7,8. Кроме того, для проточной цитометрии полного спектра используются детекторы APD (лавинные фотодиоды), которые имеют повышенную чувствительность по сравнению с лампочными детекторами фотоумножителя, присутствующими на обычных проточных цитометрах8. Следовательно, этот подход идеально подходит для гетерогенных клеточных популяций, таких как мононуклеарные клетки периферической крови или суспензии вторичных клеток лимфоидных органов у мышей, поскольку он устраняет необходимость выделения специфических популяций Т-клеток перед маркировкой кальциевым красителем. Вместо этого профили экспрессии маркеров клеточной поверхности и стробирование проточной цитометрии после сбора данных могут быть использованы для оценки кальциевых реакций в каждой интересующей популяции. Как показано в этом отчете, Indo-1 можно легко комбинировать с восемью флуорохром-конъюгированными антителами, в результате чего в общей сложности получается 10 уникальных спектральных сигнатур. Кроме того, этот метод может быть легко применен к смесям клеток из конгенно различных линий мышей, что позволяет проводить одновременный анализ кальциевых реакций в Т-клетках дикого типа по сравнению с таковыми из линии мышей, нацеленных на гены.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе описывается оптимизированный анализ, предназначенный для измерения кальциевых реакций в первичных мышиных Т-клетках, загруженных титрованным индикаторным красителем Indo-1 ratiometric, с использованием проточной цитометрииполного спектра 7,8….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01AI132419, CU | Общий ресурс AMC ImmunoMicro Flow Cytometry, RRID:SCR_021321, Большое спасибо нашим коллегам из Cytek за постоянные обсуждения полного спектрального цитометрического анализа в программном обеспечении Aurora и SpectroFlo. Фигуры были созданы с помощью BioRender.com.
Materials
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
- June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , (2004).
- Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
- Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
- Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
- Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
- Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
- Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
- Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022)
- SpctroFlo Software. Cytek Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022)
- FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022)
- Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
- Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).
