ניתוח של זרימת סידן המושרה על ידי קולטן תאי T בתאי T מורין ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא
Summary
זרם סידן, מדד לאיתות תאי T, הוא דרך יעילה לנתח תגובות לגירוי קולטן תאי T. פרוטוקול זה לריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא מנצל את היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא.
Abstract
זרימת סידן בתגובה לגירוי קולטן תאי T היא מדד נפוץ של איתות תאי T. מספר צבעי מחוון סידן פותחו כדי להעריך איתות סידן על ידי ציטומטריית זרימה של מעבר פסים. פרוטוקול זה נועד למדוד תגובות סידן בתאי T מורינים ראשוניים באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. סך כל הטחול מסומן בצבע אינדיקטור הסידן היחסי Indo-1, יחד עם פאנל של נוגדנים מצומדים פלואורוכרום למולקולות פני התא. מינוף היכולות של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא מספק פלטפורמה לשימוש במגוון רחב של כתמים על פני התא בשילוב עם Indo-1. לאחר מכן תאים מנותחים בזמן אמת ב 37 ° C לפני ואחרי תוספת של נוגדן אנטי CD3 כדי לעורר את קולטן תא T. לאחר פירוק האותות הספקטרליים, מחושב היחס בין Indo-1 הקשור לסידן ללא סידן וניתן לדמיין אותו לאורך זמן עבור כל אוכלוסייה מגודרת של טחול. טכניקה זו יכולה לאפשר ניתוח סימולטני של תגובות סידן באוכלוסיות תאים מרובות.
Introduction
זרם סידן המושרה על ידי קולטן תאי T (TCR) הוא מדד שימושי להפעלת תאי T ומשמש לעתים קרובות כדי לקבוע אם לאוכלוסייה של תאי T יש תגובות לקויות בשלבים הפרוקסימליים של מסלול איתות TCR1. מדידות של זרימת סידן מבוצעות בדרך כלל על ידי תיוג מראש של תאי T עם אחד או זוג צבעי מחוון סידן פלואורסצנטיים, ולאחר מכן בחינת האותות הפלואורסצנטיים באמצעות ציטומטריית זרימה בזמן אמת לאחר TCR cross-linking 2,3,4. Indo-1, צבע סידן מטרי, מעורר על ידי לייזר UV עם פליטת שיא בשני אורכי גל שונים התלויים בקשירת סידן5, והוא צבע אינדיקטור נפוץ לניתוח ציטומטריית זרימה של תגובות סידן בלימפוציטים חיים. מכיוון שפרופיל הפליטה של Indo-1 הוא רחב למדי, זה יכול להיות מאתגר לשלב הערכת Indo-1 עם ניתוח סימולטני של סמני פני תא מרובים על ידי ציטומטריית זרימה של מעבר פס. מגבלה זו מגבילה את השימוש בניתוח ציטומטריית זרימה של תגובות סידן לאוכלוסיות מטוהרות מראש של תאי T או לאוכלוסיות המזוהות על ידי קבוצה מוגבלת של מולקולות פני התא.
כדי להתמודד עם המגבלות של מדידת תגובות סידן על אוכלוסיות הטרוגניות של לימפוציטים ראשוניים באמצעות ציטומטריית זרימה של מעבר פסים, פותח פרוטוקול למדידת פלואורסצנטיות Indo-1 באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. שיטה זו מאפשרת ריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא, תוך ניצול היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. היתרון בשימוש בציטומטריית זרימה בספקטרום מלא על פני ציטומטריית זרימה קונבנציונלית הוא היכולת להבחין בין אותות פלואורסצנטיים לצבעים חופפים מאוד, ובכך להגדיל את מספר סמני פני השטח שניתן להעריך בו זמנית בכל דגימה. ציטומטריית זרימה קונבנציונלית משתמשת במסנני פסים ומוגבלת לפלואורוכרום אחד לכל מערכת גלאים6. ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא אוספת אותות על פני כל הספקטרום של הפלואורוכרום באמצעות 64 גלאים במערכת ציטומטריית זרימה ספקטרליתשל חמישה לייזרים 7,8. בנוסף, ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא מנצלת את גלאי APD (Avalanche Photo Diode) בעלי רגישות מוגברת ביחס לגלאי צינור מכפיל אורהקיימים בציטומדי זרימה קונבנציונליים 8. כתוצאה מכך, גישה זו אידיאלית עבור אוכלוסיות תאים הטרוגניות, כגון תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם או תרחיפים של תאי איברי לימפה משניים מורין, מכיוון שהיא מבטלת את הצורך בבידוד של אוכלוסיות תאי T ספציפיות לפני סימון צבע הסידן. במקום זאת, ניתן להשתמש בפרופילי ביטוי של סמני פני השטח של התא ובציטומטריית זרימה לאחר איסוף נתונים כדי להעריך את תגובות הסידן בכל אוכלוסייה מעוניינת בהן. כפי שניתן לראות בדו”ח זה, ניתן לשלב את Indo-1 בקלות עם שמונה נוגדנים מצומדים פלואורוכרום, וכתוצאה מכך בסך הכל 10 חתימות ספקטרליות ייחודיות. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות על תערובות של תאים מקווי עכבר מובחנים באופן קונגני, מה שמאפשר ניתוח סימולטני של תגובות סידן בתאי T מסוג בר בהשוואה לאלה מקו עכברים ממוקד גנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר בדיקה ממוטבת שנועדה למדוד תגובות סידן בתאי T ראשוניים של מורין העמוסים בצבע אינדיקטור ביחס הודו-1 באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא 7,8. היתרון בביצוע בדיקות שטף סידן באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא הוא היכולת להכפיף צביעת סמן תאי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry משאב משותף, RRID:SCR_021321, תודה רבה לעמיתינו ב- Cytek על דיונים מתמשכים של ניתוח ציטומטרי ספקטרלי מלא בתוכנות Aurora ו- SpectroFlo. דמויות נוצרו עם BioRender.com.
Materials
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
- June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , (2004).
- Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
- Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
- Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
- Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
- Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
- Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
- Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022)
- SpctroFlo Software. Cytek Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022)
- FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022)
- Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
- Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).
