זרם סידן, מדד לאיתות תאי T, הוא דרך יעילה לנתח תגובות לגירוי קולטן תאי T. פרוטוקול זה לריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא מנצל את היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח של זרימת סידן המושרה על ידי קולטן תאי T בתאי T מורין ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא
במאמר זה
סיכום
תקציר
זרימת סידן בתגובה לגירוי קולטן תאי T היא מדד נפוץ של איתות תאי T. מספר צבעי מחוון סידן פותחו כדי להעריך איתות סידן על ידי ציטומטריית זרימה של מעבר פסים. פרוטוקול זה נועד למדוד תגובות סידן בתאי T מורינים ראשוניים באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. סך כל הטחול מסומן בצבע אינדיקטור הסידן היחסי Indo-1, יחד עם פאנל של נוגדנים מצומדים פלואורוכרום למולקולות פני התא. מינוף היכולות של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא מספק פלטפורמה לשימוש במגוון רחב של כתמים על פני התא בשילוב עם Indo-1. לאחר מכן תאים מנותחים בזמן אמת ב 37 ° C לפני ואחרי תוספת של נוגדן אנטי CD3 כדי לעורר את קולטן תא T. לאחר פירוק האותות הספקטרליים, מחושב היחס בין Indo-1 הקשור לסידן ללא סידן וניתן לדמיין אותו לאורך זמן עבור כל אוכלוסייה מגודרת של טחול. טכניקה זו יכולה לאפשר ניתוח סימולטני של תגובות סידן באוכלוסיות תאים מרובות.
מבוא
זרם סידן המושרה על ידי קולטן תאי T (TCR) הוא מדד שימושי להפעלת תאי T ומשמש לעתים קרובות כדי לקבוע אם לאוכלוסייה של תאי T יש תגובות לקויות בשלבים הפרוקסימליים של מסלול איתות TCR1. מדידות של זרימת סידן מבוצעות בדרך כלל על ידי תיוג מראש של תאי T עם אחד או זוג צבעי מחוון סידן פלואורסצנטיים, ולאחר מכן בחינת האותות הפלואורסצנטיים באמצעות ציטומטריית זרימה בזמן אמת לאחר TCR cross-linking 2,3,4. Indo-1, צבע סידן מטרי, מעורר על ידי לייזר UV עם פליטת שיא בשני אורכי גל שונים התלויים בקשירת סידן5, והוא צבע אינדיקטור נפו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עכברים הוחזקו בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ בהתאם לפרוטוקולים של IACUC. כל העכברים הומתו על פי תקני AAALAC.
1. הכנת תאים חיסוניים מטחול העכבר
הערה: הרדימו עכברים תמימים באמצעות המתת חסד CO2 . עכברי C57BL/6 שנרכשו ממעבדות ג'קסון וגודלו בבית משמשים לניסויים בגיל 6-12 שבועות. עכברים זכרים ונקבות כאחד משמשים לניסויים.
- יש לחטא את עור העכבר באתנול 70% על מנת לצמצם את האפשרות של מזהמים חיצוניים להיכנס לדגימה.
- נתחו את טחול העכבר באמצעות כלי דיסקציה, מספריים כירורגיים ומלקחיים. קצרו את הטחול והכניסו את הטחול המנותק לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל עם ~5 מ"ל של מדיית RP....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תהליך העבודה הניסיוני להערכת תגובות סידן בתאי T מורינים ראשוניים באמצעות צבע יחסי הודו-1 עם כתמים על פני השטח המרובבים מוצג באיור 1. לאחר קצירת ועיבוד הטחול של העכבר לתרחיף תא יחיד, התאים מוכתמים באסתר Indo-1 AM ומשטח מוכתמים בנוגדנים המקושרים לפלואורוכרום. לאחר השלמת טעינת הצבע וצביעת הנוגדנים, דגימות הלימפוציטים מתחממות לטמפרטורה ביולוגית (37 מעלות צלזיוס). הדגימות מנותחות לאחר מכן באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא עבור פלואורסצנטיות Indo-1 לאחר התאמה לסוגי התאים הבודדים הרצויים, ללא צ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר בדיקה ממוטבת שנועדה למדוד תגובות סידן בתאי T ראשוניים של מורין העמוסים בצבע אינדיקטור ביחס הודו-1 באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא 7,8. היתרון בביצוע בדיקות שטף סידן באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא הוא היכולת להכפיף צביעת סמן תאי שטח בשילוב עם הערכה של פלואורסצנטיות Indo-1. לציטומטריית זרימה בספקטרום מלא יש יתרון בכך שהיא מאפשרת שימוש בצבעים חופפים מאוד, ובכך מגדילה את מספר הסמנים שניתן להשתמש בהם בלוח. זאת בשל העובדה כי ציטומטר זרימה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר.
תודות
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry משאב משותף, RRID:SCR_021321, תודה רבה לעמיתינו ב- Cytek על דיונים מתמשכים של ניתוח ציטומטרי ספקטרלי מלא בתוכנות Aurora ו- SpectroFlo. דמויות נוצרו עם BioRender.com.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 12 צלחות מטופלות TC היטב | Cell Treat | 229111 | |
| 50 מ"ל חרוטי | גריינר Bio1 | 41-12-17-03 | 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילן עם מכסה |
| 5 מ"ל צינורות זרימת פוליסטרן | קורנינג | 352052 | |
| 5 מ"ל מזרק | BD מזרק BD | 309646 | בוכנה בלבד משמש שיית' מושלך |
| מסנן 70uM | גריינר ביו1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis מאגר | Gibco | A1049201 | |
| Aurora זרימה ספקטרלית ציטומטר | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| חרוזי אמבטיה | קולפרמר | פריט # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d טטרמר APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| חממת תאים | מדעיים | ||
| מלקחיים | McKesson | #487593 | מלקחיים רקמות McKesson Adson באורך 4-3/4 אינץ 'נירוסטה בדרגה משרדית ידית אגודל לא סטרילית שאינה נעילה 1 x 2 |
| כלי חיתוך שיניים מספריים | McKesson | #970135 | מספריים הפעלה McKesson Argent™ 4-1/2 אינץ' כירורגית כיתה כירורגית ידית טבעת אצבע מנירוסטה קצה חד ישר / קצה חד |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | חבילה AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | צבע לטעינת סידן |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל | Light Labs | A-7001 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין/L-גלוטמין | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| מטוהר נגד עכבר CD16/CD32 (FC Shield) ( 2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC בלוק |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + פנול אדום |
| RPMI ללא | פנול Gibco | 11835030 | -פנול אדום |
| צנטריפוגה שולחנית | בקמן קולטר | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | מספר מוצר: C06019 | כולל Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry Bath |
מקורות
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
