Summary

Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo

Published: December 16, 2022
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Summary

O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.

Abstract

O influxo de cálcio em resposta à estimulação do receptor de células T é uma medida comum da sinalização de células T. Vários corantes indicadores de cálcio foram desenvolvidos para avaliar a sinalização do cálcio por citometria de fluxo passa-faixa. Este protocolo é projetado para medir as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando citometria de fluxo de espectro completo. Os esplenócitos totais são marcados com o corante indicador de cálcio ratiométrico Indo-1, juntamente com um painel de anticorpos conjugados ao fluorocromo para moléculas de superfície celular. Aproveitar os recursos da citometria de fluxo de espectro completo fornece uma plataforma para utilizar uma ampla gama de colorações da superfície celular em combinação com o Indo-1. As células são então analisadas em tempo real a 37 °C antes e depois da adição de um anticorpo anti-CD3 para estimular o receptor de células T. Depois de desmisturar os sinais espectrais, a proporção de Indo-1 ligado ao cálcio e livre de cálcio é calculada e pode ser visualizada ao longo do tempo para cada população fechada de esplenócitos. Esta técnica pode permitir a análise simultânea das respostas do cálcio em múltiplas populações celulares.

Introduction

O influxo de cálcio induzido pelo receptor de células T (TCR) é uma medida útil da ativação de células T e é frequentemente usado para determinar se uma população de células T tem respostas prejudicadas nas etapas proximais da via de sinalização TCR1. As medidas do influxo de cálcio são geralmente realizadas pré-marcando as células T com um ou um par de corantes indicadores fluorescentes de cálcio e, em seguida, examinando os sinais fluorescentes usando citometria de fluxo em tempo real após a reticulação do TCR 2,3,4. O indo-1, um corante de cálcio ratio-métrico, é excitado pelo laser UV com pico de emissões em dois comprimentos de onda diferentes dependentes da ligação do cálcio5, e é um corante indicador comumente usado para análise por citometria de fluxo das respostas de cálcio em linfócitos vivos. Como o perfil de emissão de Indo-1 é bastante amplo, pode ser desafiador combinar a avaliação de Indo-1 com a análise simultânea de múltiplos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo passa-faixa. Essa limitação restringe o uso da análise por citometria de fluxo das respostas do cálcio a populações pré-purificadas de células T ou a populações identificadas por um conjunto limitado de moléculas de superfície celular.

Para abordar as limitações da medição das respostas de cálcio em populações heterogêneas de linfócitos primários usando citometria de fluxo passa-faixa, um protocolo foi desenvolvido para medir a fluorescência do Indo-1 usando citometria de fluxo de espectro completo. Este método permite a multiplexação do Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular, aproveitando as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo. A vantagem do uso da citometria de fluxo de espectro total sobre a citometria de fluxo convencional é sua capacidade de distinguir os sinais fluorescentes de corantes altamente sobrepostos, aumentando assim o número de marcadores de superfície que podem ser avaliados simultaneamente em cada amostra. A citometria de fluxo convencional utiliza filtros passa-banda e é restrita a um fluorocromo por sistema detector6. A citometria de fluxo de espectro total coleta sinais em todo o espectro do fluorocromo usando 64 detectores em um sistema de citometria de fluxo espectral de cincolasers 7,8. Além disso, a citometria de fluxo de espectro total aproveita os detectores APD (Avalanche Photo Diode) que apresentam sensibilidade aumentada em relação aos detectores de tubo fotomultiplicador presentes nos citômetros de fluxoconvencionais8. Consequentemente, esta abordagem é ideal para populações de células heterogêneas, tais como células mononucleares do sangue periférico ou suspensões de células linfoides secundárias murinas, pois elimina a necessidade do isolamento de populações específicas de células T antes da marcação do corante de cálcio. Em vez disso, os perfis de expressão de marcadores de superfície celular e o gating por citometria de fluxo após a coleta de dados podem ser usados para avaliar as respostas de cálcio em cada população de interesse. Como mostrado neste relatório, o Indo-1 pode ser prontamente combinado com oito anticorpos conjugados ao fluorocromo, resultando em um total de 10 assinaturas espectrais únicas. Além disso, este método pode ser prontamente aplicado a misturas de células de linhagens de camundongos congenicamente distintas, permitindo a análise simultânea das respostas de cálcio em células T selvagens em comparação com aquelas de uma linhagem de camundongos direcionada a genes.

Protocol

Os camundongos foram mantidos no campus de Medicina da Universidade do Colorado Anschutz de acordo com os protocolos da IACUC. Todos os camundongos foram eutanasiados de acordo com os padrões da AAALAC. 1. Preparação de células imunes do baço de camundongo NOTA: Eutanásia de camundongos ingênuos com eutanásia por CO2 . Camundongos C57BL/6 comprados do Jackson Laboratories e criados internamente são usados para experimentos com 6-12…

Representative Results

O fluxo de trabalho experimental para avaliar as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando um corante ratiométrico Indo-1 com coloração superficial multiplexadora é mostrado na Figura 1. Após a colheita e processamento dos esplenócitos de camundongos em uma única suspensão celular, as células são coradas com um éster Indo-1 AM e a superfície corada com anticorpos ligados ao fluorocromo. Uma vez concluída a carga do corante e a coloração de anticorpos, as amo…

Discussion

Este protocolo descreve um ensaio otimizado projetado para medir as respostas de cálcio em células T primárias murinas carregadas com corante indicador ratiométrico Indo-1 titulado usando citometria de fluxo de espectro completo 7,8. A vantagem de realizar ensaios de fluxo de cálcio usando citometria de fluxo de espectro total é a capacidade de coloração de marcadores de superfície celular multiplex em combinação com a avaliação da fluorescência do …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R01AI132419, – Brasil | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Muito obrigado aos nossos colegas da Cytek por discussões contínuas de análise citométrica espectral completa no software Aurora e SpectroFlo. As figuras foram criadas com BioRender.com.

Materials

12 well TC treated plates Cell Treat 229111
50 mL conical Greiner Bio1 41-12-17-03 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes Corning 352052
5mL syringe BD syringe 309646 plunger only is used sheith is discarded
70uM filter Greiner bio1 542070
aCD3 (17A2) Biolegend 100202
AKC lysis Buffer Gibco A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads coleparmer Item # UX-06274-52
CD19 PE Tonbo 50-0193-U100
CD1d Tetramer APC NIH
CD25 PECy7 ebioscience 15-0251
CD4 APC Cy7 Tonbo 25-0042-U100
CD8a FITC ebioscience 11-0081-85
Cell Incubator Formal Scientific
Dissection Tools forceps McKesson #487593 Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors McKesson #970135 Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x Gibco 14190-136 DPBS 
EGTA Fisher NC1280093
FBS Hyclond SH30071.03 lot AE29165301
FlowJo Software https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye ebioscience 65-085-39 Calcium Loading Dye 
ionomycin Millipore 407951-1mg
Live/Dead Ghost 540 Tonbo 13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL Light Labs A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine Gibco 10378-016
PRN694 Med Chem Express Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) Tonbo 70-0161-M001 FC Block
RPMI Gibco 1875093  + phenol red
RPMI phenol free Gibco 11835030  -phenol red
Table top centrifuge Beckman Coulter Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5 ebioscience 45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5 ebioscience 15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack Product No: C06019 Includes Tripan
Vi-Cell Blu Beckman Coulter
Waterbath Fisher Brand Dry bath

References

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Cite This Article
Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (190), e64526, doi:10.3791/64526 (2022).

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