Analyse van T-celreceptor-geïnduceerde calciuminstroom in primaire muizen T-cellen door full spectrum flow cytometrie
Summary
Calciuminflux, een maat voor T-celsignalering, is een effectieve manier om reacties op T-celreceptorstimulatie te analyseren. Dit protocol voor het multiplexen van Indo-1 met panelen van antilichamen gericht op celoppervlakmoleculen maakt gebruik van de zeer flexibele mogelijkheden van volledige spectrum flowcytometrie.
Abstract
Calciuminstroom als reactie op T-celreceptorstimulatie is een veel voorkomende maat voor T-celsignalering. Verschillende calciumindicatorkleurstoffen zijn ontwikkeld om calciumsignalering te beoordelen door band-pass flowcytometrie. Dit protocol is ontworpen om calciumresponsen in primaire murine T-cellen te meten met behulp van full spectrum flowcytometrie. Totale splenocyten worden gelabeld met de ratiometrische calciumindicatorkleurstof Indo-1, samen met een panel van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen celoppervlakmoleculen. Het benutten van de mogelijkheden van full spectrum flowcytometrie biedt een platform voor het gebruik van een breed scala aan celoppervlakvlekken in combinatie met Indo-1. Cellen worden vervolgens in real-time geanalyseerd bij 37 °C voor en na de toevoeging van een anti-CD3-antilichaam om de T-celreceptor te stimuleren. Na het ontmengen van de spectrale signalen wordt de verhouding van calciumgebonden tot calciumvrije Indo-1 berekend en kan deze in de loop van de tijd worden gevisualiseerd voor elke gated populatie van splenocyten. Deze techniek kan de gelijktijdige analyse van calciumresponsen in meerdere celpopulaties mogelijk maken.
Introduction
T-celreceptor (TCR) geïnduceerde calciuminflux is een nuttige maat voor T-celactivatie en wordt vaak gebruikt om te bepalen of een populatie T-cellen verminderde reacties heeft in de proximale stappen van de TCR-signaleringsroute1. Metingen van calciuminstroom worden over het algemeen uitgevoerd door de T-cellen vooraf te labelen met één of een paar fluorescerende calciumindicatorkleurstoffen en vervolgens de fluorescerende signalen te onderzoeken met behulp van flowcytometrie in realtime na TCR-crosslinking 2,3,4. Indo-1, een ratio-metrische calciumkleurstof, wordt geëxciteerd door de UV-laser met piekemissies op twee verschillende golflengten, afhankelijk van calciumbinding5, en is een veelgebruikte indicatorkleurstof voor flowcytometrie-analyse van calciumresponsen in levende lymfocyten. Omdat het emissieprofiel van Indo-1 vrij breed is, kan het een uitdaging zijn om Indo-1-beoordeling te combineren met gelijktijdige analyse van meerdere celoppervlakmarkers door band-pass flowcytometrie. Deze beperking beperkt het gebruik van flowcytometrie-analyse van calciumresponsen op voorgezuiverde populaties van T-cellen of op populaties geïdentificeerd door een beperkte set celoppervlakmoleculen.
Om de beperkingen van het meten van calciumresponsen op heterogene populaties van primaire lymfocyten met behulp van band-pass flowcytometrie aan te pakken, werd een protocol ontwikkeld om Indo-1 fluorescentie te meten met behulp van full spectrum flow cytometrie. Deze methode maakt het mogelijk om Indo-1 te multiplexen met panelen van antilichamen gericht op celoppervlakmoleculen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de zeer flexibele mogelijkheden van volledige spectrum flowcytometrie. Het voordeel van het gebruik van full spectrum flowcytometrie ten opzichte van conventionele flowcytometrie is het vermogen om de fluorescerende signalen te onderscheiden van sterk overlappende kleurstoffen, waardoor het aantal oppervlaktemarkers dat tegelijkertijd in elk monster kan worden beoordeeld, toeneemt. Conventionele flowcytometrie maakt gebruik van bandpassfilters en is beperkt tot één fluorochroom per detectorsysteem6. Full spectrum flowcytometrie verzamelt signalen over het gehele spectrum van het fluorochroom met behulp van 64 detectoren op een vijf-laser spectraal flowcytometriesysteem 7,8. Bovendien maakt full spectrum flowcytometrie gebruik van APD-detectoren (Avalanche Photo Diode) die een verhoogde gevoeligheid hebben ten opzichte van fotomultiplicatorbuisdetectoren die aanwezig zijn op conventionele flowcytometers8. Bijgevolg is deze aanpak ideaal voor de heterogene celpopulaties, zoals perifere mononucleaire bloedcellen of muriene secundaire lymfoïde orgaancelsuspensies, omdat het de noodzaak voor de isolatie van specifieke T-celpopulaties voorafgaand aan calciumkleurstofetikettering elimineert. In plaats daarvan kunnen celoppervlakmarkerexpressieprofielen en flowcytometriegating na gegevensverzameling worden gebruikt om calciumresponsen in elke relevante populatie te beoordelen. Zoals aangetoond in dit rapport, kan Indo-1 gemakkelijk worden gecombineerd met acht fluorochroom-geconjugeerde antilichamen, wat resulteert in een totaal van 10 unieke spectrale handtekeningen. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden toegepast op mengsels van cellen uit congenetisch verschillende muizenlijnen, waardoor de gelijktijdige analyse van calciumresponsen in wildtype T-cellen mogelijk is in vergelijking met die van een gengerichte muizenlijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde test die is ontworpen om calciumresponsen te meten in primaire muizen T-cellen geladen met getitreerde Indo-1 ratiometrische indicatorkleurstof met behulp van full spectrum flowcytometrie 7,8. Het voordeel van het uitvoeren van calciumfluxtesten met behulp van volledige spectrum flowcytometrie is de mogelijkheid om oppervlaktecelmarkerkleuring te multiplexen in combinatie met beoordeling van Indo-1-fluorescentie. Full …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Veel dank aan onze collega’s bij Cytek voor voortdurende discussies over volledige spectrale cytometrische analyse op de Aurora en SpectroFlo software. Figuren werden gemaakt met BioRender.com.
Materials
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
- June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , (2004).
- Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
- Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
- Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
- Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
- Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
- Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
- Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022)
- SpctroFlo Software. Cytek Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022)
- FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022)
- Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
- Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).
