Der Kalziumeinstrom, ein Maß für die T-Zell-Signalübertragung, ist ein effektiver Weg, um Reaktionen auf die Stimulation von T-Zell-Rezeptoren zu analysieren. Dieses Protokoll zum Multiplexen von Indo-1 mit Antikörpern, die auf Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, nutzt die hochflexiblen Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie.
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Methodenartikel
Analyse des T-Zellrezeptor-induzierten Kalziumeinstroms in primäre murine T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Kalziumeinstrom als Reaktion auf die Stimulation durch T-Zell-Rezeptoren ist ein gängiges Maß für die T-Zell-Signalübertragung. Es wurden mehrere Calcium-Indikatorfarbstoffe entwickelt, um die Calcium-Signalübertragung mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie zu messen. Die gesamten Splenozyten werden mit dem ratiometrischen Calciumindikatorfarbstoff Indo-1 markiert, zusammen mit einer Reihe von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen Zelloberflächenmoleküle. Die Nutzung der Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie bietet eine Plattform für die Verwendung einer breiten Palette von Zelloberflächenfärbungen in Kombination mit Indo-1. Die Zellen werden dann in Echtzeit bei 37 °C vor und nach der Zugabe eines Anti-CD3-Antikörpers zur Stimulation des T-Zell-Rezeptors analysiert. Nach der Entmischung der spektralen Signale wird das Verhältnis von calciumgebundenem zu calciumfreiem Indo-1 berechnet und kann über die Zeit für jede Gated Population von Splenozyten visualisiert werden. Diese Technik kann die gleichzeitige Analyse von Kalziumantworten in mehreren Zellpopulationen ermöglichen.
Einleitung
Der durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) induzierte Kalziumeinstrom ist ein nützliches Maß für die T-Zell-Aktivierung und wird häufig verwendet, um festzustellen, ob eine Population von T-Zellen eine beeinträchtigte Reaktion in den proximalen Schritten des TCR-Signalwegsaufweist 1. Messungen des Kalziumeinstroms werden in der Regel durchgeführt, indem die T-Zellen mit einem oder zwei fluoreszierenden Kalziumindikatorfarbstoffen vormarkiert und dann die Fluoreszenzsignale mittels Durchflusszytometrie in Echtzeit nach TCR-Vernetzung untersuchtwerden 2,3,4.
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Protokoll
Die Mäuse wurden auf dem medizinischen Campus der University of Colorado Anschutz in Übereinstimmung mit den IACUC-Protokollen gehalten. Alle Mäuse wurden nach AAALAC-Standards eingeschläfert.
1. Präparation von Immunzellen aus der Milz der Maus
HINWEIS: Naive Mäuse mit CO2 -Euthanasie einschläfern. C57BL/6-Mäuse, die von Jackson Laboratories gekauft und im eigenen Haus gezüchtet wurden, werden für Experimente im Alter von 6-12 Wochen verwendet. Für Experimente werden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet.
- Desinfizieren Sie die Mäusehaut mit 70%igem Ethanol, um ....
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Ergebnisse
Der experimentelle Arbeitsablauf zur Beurteilung der Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen unter Verwendung eines ratiometrischen Indo-1-Farbstoffs mit Multiplex-Oberflächenfärbungen ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach der Ernte und Aufbereitung der Maus-Splenozyten zu einer Einzelzellsuspension werden die Zellen mit einem Indo-1 AM-Ester gefärbt und mit Fluorochrom-verknüpften Antikörpern oberflächengefärbt. Nach Abschluss der Farbstoffbeladung und der Antikörperfärbung werden die .......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Assay zur Messung von Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen, die mit titriertem Indo-1-ratiometrischem Indikatorfarbstoff unter Verwendung der Vollspektrum-Durchflusszytometrie beladen sind 7,8. Der Vorteil der Durchführung von Calciumfluss-Assays mit Vollspektrum-Durchflusszytometrie ist die Möglichkeit, die Färbung von Oberflächenzellmarkern in Kombination mit der Beurteilung der Indo-1-Fluoreszenz zu multip.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Vielen Dank an unsere Kollegen bei Cytek für die kontinuierlichen Diskussionen über die vollständige spektralzytometrische Analyse mit der Aurora- und SpectroFlo-Software. Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 12 Well TC-behandelte Platten | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL konisch | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen mit Kappe |
| 5 mL Polysteren-Durchflussröhrchen | Corning | 352052 | |
| 5 mL Spritze | BD Spritze | 309646 | Kolben wird verwendet |
| 70 μM Filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | Coleparmer | Artikel # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Zellinkubator | Formale wissenschaftliche | ||
| Dissektionswerkzeuge Pinzette | McKesson | #487593 | Gewebezange McKesson Adson 4-3/4 Zoll Länge Edelstahl in Büroqualität Nicht steriler nicht verriegelnder Daumengriff 1 x 2 Zähne |
| Dissektionswerkzeuge Schere | McKesson | # 970135 | Operationsschere McKesson Argent™ 4-1/2 Zoll Chirurgischer Edelstahl Fingerring Griff Gerade Scharfe Spitze / Scharfe Spitze |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | Lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| Ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Lebender/toter Geist 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen 1,7 mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Gereinigtes Anti-Maus-CD16/CD32 (FC-Schild) ( 2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenolrot |
| RPMI phenolfrei | Gibco | 11835030 | -phenolrot |
| Tischzentrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagenzpaket | Produkt-Nr: C06019 | Enthält Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Wasserbad | Fisher Brand Trockenbad |
Referenzen
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N.
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Nachdrucke und Genehmigungen
