Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석
Summary
T 세포 신호 전달의 척도인 칼슘 유입은 T 세포 수용체 자극에 대한 반응을 분석하는 효과적인 방법입니다. Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화하기 위한 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용합니다.
Abstract
T 세포 수용체 자극에 대한 반응으로 칼슘 유입은 T 세포 신호 전달의 일반적인 척도입니다. 띠 통과 유세포 분석에 의한 칼슘 신호 전달을 평가하기 위해 여러 칼슘 지표 염료가 개발되었습니다. 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 일차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 측정하도록 설계되었습니다. 총 비장 세포는 세포 표면 분자에 대한 형광 색소 접합 항체 패널과 함께 비율 계량 칼슘 지표 염료 Indo-1로 표지됩니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석의 기능을 활용하면 Indo-1과 함께 다양한 세포 표면 염색을 활용할 수 있는 플랫폼이 제공됩니다. 이어서, 세포는 T 세포 수용체를 자극하기 위해 항-CD3 항체의 첨가 전후에 37°C에서 실시간으로 분석된다. 스펙트럼 신호를 혼합하지 않은 후, 칼슘 결합 대 칼슘이 없는 Indo-1의 비율이 계산되고 비장 세포의 각 게이트 집단에 대해 시간 경과에 따라 시각화될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 여러 세포 집단에서 칼슘 반응을 동시에 분석할 수 있습니다.
Introduction
T 세포 수용체(TCR) 유도 칼슘 유입은 T 세포 활성화의 유용한 척도이며 T 세포 집단이 TCR 신호 전달 경로1의 근위 단계에서 손상된 반응을 갖는지 여부를 결정하는 데 자주 사용됩니다. 칼슘 유입의 측정은 일반적으로 하나 또는 한 쌍의 형광 칼슘 지시약 염료로 T 세포를 사전 표지한 다음 TCR 가교후 실시간으로 유세포 분석을 사용하여 형광 신호를 검사하여 수행됩니다 2,3,4. 비율 미터법 칼슘 염료인 Indo-1은 칼슘 결합5에 따라 두 가지 다른 파장에서 피크 방출로 UV 레이저에 의해 여기되며, 살아있는 림프구의 칼슘 반응에 대한 유세포 분석 분석에 일반적으로 사용되는 지표 염료입니다. Indo-1의 방출 프로파일이 매우 광범위하기 때문에 Indo-1 평가와 대역 통과 유세포 분석에 의한 여러 세포 표면 마커의 동시 분석을 결합하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 제한은 T 세포의 사전 정제된 집단 또는 제한된 세포 표면 분자 세트에 의해 식별된 집단에 대한 칼슘 반응의 유세포 분석 분석의 활용을 제한합니다.
띠통과 유세포 분석을 사용하여 원발성 림프구의 이질적인 집단에 대한 칼슘 반응 측정의 한계를 해결하기 위해 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 Indo-1 형광을 측정하는 프로토콜이 개발되었습니다. 이 방법을 사용하면 Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화할 수 있으며, 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용할 수 있습니다. 기존의 유세포 분석에 비해 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하면 형광 신호와 고도로 겹치는 염료를 구별할 수 있어 각 샘플에서 동시에 평가할 수 있는 표면 마커의 수가 증가한다는 장점이 있습니다. 종래의 유세포 분석은 대역통과 필터를 사용하며, 검출기 시스템당 하나의 형광색소로 제한된다6. 전체 스펙트럼 유세포 분석은 5-레이저 스펙트럼 유세포 분석 시스템 7,8에서 64개의 검출기를 사용하여 형광색소의 전체 스펙트럼에 걸쳐 신호를 수집합니다. 또한, 전체 스펙트럼 유세포 분석은 종래의 유세포 분석기에 존재하는 광전자 증배관 검출기에 비해 감도가 증가한 APD(Avalanche Photo Diode) 검출기를 이용한다8. 결과적으로, 이 접근법은 칼슘 염료 표지 전에 특정 T 세포 집단을 분리할 필요가 없기 때문에 말초 혈액 단핵 세포 또는 쥐 이차 림프 기관 세포 현탁액과 같은 이종 세포 집단에 이상적입니다. 대신, 데이터 수집 후 세포 표면 마커 발현 프로필 및 유세포 분석 게이팅을 사용하여 각 관심 집단에서 칼슘 반응을 평가할 수 있습니다. 이 보고서에서 볼 수 있듯이 Indo-1은 8개의 형광색소 접합 항체와 쉽게 결합되어 총 10개의 고유한 스펙트럼 시그니처를 생성할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 선천적으로 구별되는 마우스 계통의 세포 혼합물에 쉽게 적용할 수 있어 유전자 표적 마우스 계통의 칼슘 반응과 비교하여 야생형 T 세포의 칼슘 반응을 동시에 분석할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석 7,8을 사용하여 적정된 Indo-1 비율계량 지표 염료가 로드된 1차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 측정하도록 설계된 최적화된 분석을 설명합니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 칼슘 플럭스 분석을 수행하는 이점은 Indo-1 형광 평가와 함께 표면 세포 마커 염색을 멀티플렉싱할 수 있다는 것입니다. 전체 스펙?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro 유세포 분석 공유 리소스, RRID:SCR_021321, Aurora 및 SpectroFlo 소프트웨어에 대한 전체 스펙트럼 세포 분석 분석에 대한 지속적인 논의를 해주신 Cytek의 동료들에게 깊은 감사를 드립니다. 피규어는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
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