استراتيجية قائمة على كريسبر بخطوة واحدة لوضع العلامات الجينية الداخلية في ذبابة الفاكهة الميلانية
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا مبسطا لوضع علامات على الجينات الداخلية لذبابة الفاكهة ، والذي يستخدم تقنية قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد التعديلات الجينية الناجحة بدون علامات ، مما يسهل تطوير خطوط طرق ثابتة.
Abstract
لقد تحولت دراسة توطين البروتين تحت الخلوي وديناميكياته وتنظيمه في الخلايا الحية بشكل عميق من خلال ظهور التقنيات التي تسمح بوضع علامات على الجينات الداخلية لإنتاج بروتينات الاندماج الفلورية. تمكن هذه الطرق الباحثين من تصور سلوك البروتين في الوقت الفعلي ، مما يوفر رؤى قيمة حول وظائفهم وتفاعلاتهم داخل البيئة الخلوية. تستخدم العديد من دراسات وضع العلامات الجينية الحالية عملية من خطوتين حيث يتم استخدام العلامات المرئية ، مثل تغيرات لون العين ، لتحديد الكائنات المعدلة وراثيا في الخطوة الأولى ، ويتم استئصال العلامة المرئية في الخطوة الثانية. هنا ، نقدم بروتوكولا من خطوة واحدة لإجراء علامات جينية داخلية دقيقة وسريعة في ذبابة الفاكهة الميلانية ، والتي تتيح فحص الخطوط المهندسة بدون علامة العين المرئية ، مما يوفر ميزة كبيرة على الطرق السابقة. للكشف عن أحداث وضع العلامات الجينية الناجحة ، نستخدم تقنية قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل للنمط الجيني للذباب الفردي من خلال تحليل جزء صغير من ساقه الوسطى. ثم يتم استخدام الذباب الذي يجتاز معايير الفحص لإنتاج مخزونات مستقرة. هنا ، نوضح بالتفصيل تصميم وبناء بلازميدات تحرير كريسبر وطرق فحص وتأكيد الخطوط الهندسية. يعمل هذا البروتوكول معا على تحسين كفاءة وضع العلامات الجينية الداخلية في ذبابة الفاكهة بشكل كبير ويتيح دراسات العمليات الخلوية في الجسم الحي.
Introduction
ظهرت البروتينات الفلورية كأدوات قوية لتصور توطين البروتين وديناميكياته وتفاعلات البروتين والبروتين في الخلايا داخل الكائنات الحية 1,2. يتيح وضع علامات على الجينات الداخلية باستخدام البروتينات الفلورية التصوير الحي طويل المدى للعمليات الخلوية بدقة دون خلوية. علاوة على ذلك ، فإن تقنيات وضع العلامات الجينية الداخلية هذه لها العديد من المزايا مقارنة بنهج الإفراط في التعبير والمناعة المناعية. على سبيل المثال ، قد يؤدي الإفراط في التعبير عن البروتينات إلى اختلال البروتين ، والتفاعلات غير المحددة بين البروتين والبروتين ، وسوء التوطين3. حتى الآن ، تمكن الباحثون من إنشاء مكتبات واسعة من الجينات الداخلية المنصهرة في البروتينات الفلورية لعدد قليل من الكائنات الحية النموذجية ، مثل الخميرة الناشئة ، والتي يمكن أن تخضع لإعادة التركيب المتماثل الفعال4. في حالة ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، تم ابتكار أدوات مختلفة مثل MiMICs5 ، ومصائد المحسن القائمة على الترانسبوزون6 ، والحفريات7 لوضع علامات على الجينات الفلورية.
أتاح تطوير الأدوات المستندة إلى CRISPR-Cas9 إجراء تحرير الجينوم بكفاءة ، بما في ذلك وضع علامات على البروتينات الداخلية ، في مجموعة واسعة من الكائنات الحيةالنموذجية 8,9. Cas9 هو إنزيم موجه بالحمض النووي الريبي يشق الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بطريقة عالية الكفاءةومحددة 8 ، والتي يمكن إصلاحها بعد ذلك عن طريق مسار ربط نهاية غير متماثل (NHEJ) يؤدي إلى طفرات نقطية أو حذف. بدلا من ذلك ، يسمح مسار الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) بدمج الحمض النووي غير المتجانس في الكروموسوم.
اعتمدت الطرق السابقة لوضع العلامات الجينية القائمة على كريسبر في الكائن الحي النموذجي ، ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، على عملية من خطوتين10،11،12. يتضمن ذلك استخدام علامة لون العين المميزة ، Dsred ، لاكتشاف أحداث HDR الناجحة. بعد ذلك ، سيتم استئصال علامة Dsred باستخدام نظام إعادة التركيب Cre / loxP. لتبسيط هذه العملية وتسريعها ، نقدم هنا طريقة أبسط وأكثر كفاءة. يتحايل هذا النهج على الحاجة إلى التنميط الجيني القاتل ويسمح بالفحص المباشر للذباب الفردي. على وجه التحديد ، نستخدم نهجا قائما على تفاعل البوليميراز المتسلسل لاستخراج الحمض النووي من جزء صغير من الساق الوسطى للذبابة ، مما يسمح لنا بالتنميط الجيني للذباب الفردي. والجدير بالذكر أن هذا الإجراء لا يضر بالحيوية أو الحركة أو القدرات الإنجابية للذبابة التي تم أخذ عينات منها. فقط الأفراد المناسبين ، الذين تم تحديدهم من خلال هذه الطريقة ، يتم تطويرهم إلى مخزونات مستقرة.
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتوليد الذباب الموسوم بالبروتين الفلوري حيث يتم تمييز الجينات الداخلية بمراسلي الفلورسنت. تستخدم هذه التقنية تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 لدمج أي علامة فلوروفور مرغوبة مع الطرف N أو C للجين الداخلي. أدناه ، نصف تصميم وبناء بلازميدات gRNA والبلازميد المتبرع ، واستراتيجية الفحص من خطوة واحدة لاختيار الذباب الإيجابي لكريسبر ، وخطوات إنشاء خطوط مستقرة. على وجه التحديد ، نصف استراتيجيات لوضع علامة على جين ذبابة الفاكهة الأساسي الداخلي ، الدورة ، مع فلوروفور في المحطة C. كما نصف بإيجاز تجارب التحكم التي يجب إجراؤها للتأكد من أن البروتين الموسوم هو تقنيات وظيفية وتصوير حية لتصور بروتين الدورة الشهرية في الخلايا العصبية الحية على مدار الساعة داخل أدمغة ذبابة الفاكهة السليمة 13. ينطبق البروتوكول الموصوف هنا أيضا على نطاق واسع على فحص المرشحين لحذف وإدخال أجزاء معينة من الحمض النووي عن طريق تحرير الجينوم CRISPR-Cas9.
Protocol
Representative Results
Discussion
تظهر النتائج استراتيجية مبسطة وبسيطة من خطوة واحدة تعتمد على كريسبر لوضع علامات على الجينات الداخلية في ذبابة الفاكهة. في البروتوكول ، نستخدم اثنين من gRNAs لتحفيز كسر الشريط المزدوج للحمض النووي وإعادة التركيب المتماثل بشكل أكثر كفاءة. يتم حقن gRNAs والبلازميد المتبرع في أجنة ذبابة الف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جورج واتاس وجوزي كلوني على المناقشات خلال المراحل الأولى من تطوير البروتوكول. تم دعم العمل بأموال من المعاهد الوطنية للصحة (المنحة رقم R35GM133737 إلى SY) ، وزمالة Alfred P. Sloan (إلى S. Y.) وجائزة McKnight Scholar (إلى S. Y.).
Materials
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
References
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
- Quinones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. 유전학. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. Elife. 5, e12068 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. 유전학. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kanca, O., et al. An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms. Elife. 8, e51539 (2019).
- Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9. Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).
- Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).
- Kanca, O., et al. An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination. Elife. 11, e76077 (2022).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).
- Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila. Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).
- Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region. J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).
