Drosophila melanogaster의 내인성 유전자 태깅을 위한 원스텝 CRISPR 기반 전략
Summary
여기에서는 성공적인 유전자 변형의 마커 없는 식별을 위해 PCR 기반 기술을 활용하여 안정적인 knock-in 라인의 개발을 촉진하는 초파리에 대한 단순화된 내인성 유전자 태깅 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
살아있는 세포에 있는 단백질 subcellular 국소화, 동역학 및 규칙에 대한 학문은 형광 융합 단백질을 생성하기 위하여 내인성 유전자의 표를 붙이는 것을 허용하는 기술의 출현에 의해 근본적으로 변형되었습니다. 이러한 방법을 통해 연구자들은 단백질 거동을 실시간으로 시각화하여 세포 환경 내에서 단백질의 기능과 상호 작용에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 현재 많은 유전자 태그 연구는 첫 번째 단계에서 눈 색깔 변화와 같은 가시 마커를 사용하여 유전자 변형 유기체를 식별하고 두 번째 단계에서 가시 마커를 제거하는 2단계 프로세스를 사용합니다. 여기에서는 눈에 보이는 아이 마커 없이 조작된 라인을 스크리닝할 수 있는 Drosophila melanogaster에서 정확하고 신속한 내인성 유전자 태깅을 수행하기 위한 원스텝 프로토콜을 제시하여 기존 방법에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 성공적인 유전자 태그 부착 이벤트를 스크리닝하기 위해 PCR 기반 기술을 사용하여 중간 다리의 작은 부분을 분석하여 개별 파리의 유전자형을 분석합니다. 스크리닝 기준을 통과한 파리는 안정적인 주식을 생산하는 데 사용됩니다. 여기에서는 CRISPR 편집 플라스미드의 설계 및 구성과 엔지니어링 라인의 스크리닝 및 확인 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 Drosophila 에서 내인성 유전자 태깅의 효율성을 크게 향상시키고 생체 내 세포 과정 연구를 가능하게 합니다.
Introduction
형광 단백질은 살아있는 유기체 내 세포의 단백질 국소화, 역학 및 단백질-단백질 상호 작용을 시각화하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다 1,2. 형광 단백질로 내인성 유전자를 태깅하면 세포 내 분해능으로 세포 과정의 장기 라이브 이미징이 가능합니다. 또한, 이러한 내인성 유전자 표지 기술은 과발현 및 면역염색 접근법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 단백질의 과발현은 단백질 잘못 접힘, 비특이적 단백질-단백질 상호작용 및 잘못된 국소화를 유발할 수 있다3. 현재까지 연구자들은 효율적인 상동 재조합을 겪을 수 있는 신진 효모와 같은 몇 가지 모델 유기체를 위해 형광 단백질에 융합된 내인성 유전자의 방대한 라이브러리를 만들 수 있었다4. Drosophila melanogaster의 경우, 유전자를 형광 태깅하기 위해 MiMICs5, transposon 기반 enhancer traps6 및 fosmids7과 같은 다양한 도구가 고안되었습니다.
CRISPR-Cas9 기반 도구의 개발로 광범위한 모델 유기체 8,9에서 내인성 단백질 태깅을 포함한 게놈 편집을 효율적으로 수행할 수 있게 되었습니다. Cas9은 매우 효율적이고 특이적인 방식으로 이중 가닥 DNA를 절단하는 RNA 유도 효소입니다.8 그런 다음 점 돌연변이 또는 결실로 이어지는 비상동 말단 결합(NHEJ) 경로에 의해 복구될 수 있습니다. 대안적으로, 상동성 유도 복구(homology-directed repair, HDR) 경로는 이종 DNA를 염색체에 통합할 수 있도록 합니다.
모델 유기체인 Drosophila melanogaster에서 CRISPR 기반 유전자 태깅을 위한 과거의 방법은 2단계 프로세스 10,11,12에 의존했습니다. 여기에는 식별 가능한 눈 색깔 마커인 Dsred를 사용하여 성공적인 HDR 이벤트를 감지하는 작업이 포함됩니다. 그 후, Dsred 마커는 Cre/loxP 재조합 시스템을 사용하여 절제됩니다. 이 프로세스를 간소화하고 신속하게 처리하기 위해 여기서는 더 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근법은 치명적인 유전형 분석의 필요성을 피하고 개별 파리를 직접 스크리닝할 수 있습니다. 특히, PCR 기반 접근법을 사용하여 파리의 중간 다리의 작은 부분에서 DNA를 추출하여 개별 파리의 유전자형을 분석할 수 있습니다. 주목할 만한 점은, 이 절차는 표본을 채취한 파리의 활력, 움직임 또는 번식 능력을 손상시키지 않는다는 것입니다. 이 방법을 통해 식별된 적절한 개인만이 안정적인 주식으로 더욱 발전합니다.
여기에서는 형광 리포터로 내인성 유전자를 표지하는 형광 단백질 표지 파리를 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 사용하여 원하는 형광단 태그를 내인성 유전자의 N 또는 C 말단에 융합합니다. 아래에서는 gRNA 플라스미드와 donor plasmid의 설계 및 구성, CRISPR 양성 파리를 선별하기 위한 원스텝 스크리닝 전략, 안정적인 계통을 확립하기 위한 단계에 대해 설명합니다. 구체적으로, 내인성 코어 클럭 초파리 유전자(endogenous core clock Drosophila gene, period)에 C-말단의 형광단(fluorophore)을 태그하는 전략을 설명합니다. 또한 태그된 단백질이 기능적인지 확인하기 위해 수행해야 하는 대조군 실험과 온전한 초파리 뇌 내의 생체 시계 뉴런에서 기간 단백질을 시각화하기 위한 라이브 이미징 기술에 대해 간략하게 설명합니다13. 여기에 설명된 프로토콜은 CRISPR-Cas9 게놈 편집에 의한 DNA의 특정 비트의 삭제 및 삽입을 위한 후보 물질 스크리닝에도 광범위하게 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 결과는 초파리의 내인성 유전자를 태깅하기 위한 간소화되고 간단한 CRISPR 기반 전략을 보여줍니다. 프로토콜에서는 두 개의 gRNA를 사용하여 DNA 이중 가닥 절단과 상동 재조합을 보다 효율적으로 유도합니다. gRNA와 donor plasmid는 생식세포에서 Cas9 효소를 발현하는 초파리 배아에 주입됩니다. 이 배아는 이후 성체가 될 때까지 표준 조건에서 배양되며, 성인이 되면 밸런서파리와 교배되어 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
프로토콜 개발의 초기 단계에서 논의해 주신 George Watase와 Josie Clowney에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH(보조금 번호 R35GM133737 S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship(S. Y.) 및 McKnight Scholar Award(S. Y.)의 기금으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
References
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