אסטרטגיה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה מלנוגסטר
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול תיוג גנים אנדוגני פשוט עבור דרוזופילה, המשתמש בטכניקה מבוססת PCR לזיהוי ללא סמנים של שינויים גנטיים מוצלחים, מה שמקל על פיתוח קווי דפיקה יציבים.
Abstract
המחקר של לוקליזציה תת-תאית של חלבונים, דינמיקה וויסות בתאים חיים השתנה באופן עמוק עם הופעתן של טכניקות המאפשרות תיוג של גנים אנדוגניים לייצר חלבוני היתוך פלואורסצנטיים. שיטות אלה מאפשרות לחוקרים לדמיין את התנהגות החלבונים בזמן אמת, ומספקות תובנות חשובות לגבי תפקודיהם ואינטראקציות שלהם בסביבה התאית. מחקרים רבים כיום על תיוג גנים משתמשים בתהליך דו-שלבי שבו סמנים נראים לעין, כגון שינויים בצבע העיניים, משמשים לזיהוי אורגניזמים מהונדסים גנטית בשלב הראשון, והסמן הנראה נכרת בשלב השני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חד שלבי לביצוע תיוג גנים אנדוגני מדויק ומהיר ב – Drosophila melanogaster, המאפשר סריקה לקווים מהונדסים ללא סמן העין הנראה, ומציע יתרון משמעותי על פני שיטות קודמות. כדי לסנן אירועי תיוג גנים מוצלחים, אנו משתמשים בטכניקה מבוססת PCR כדי לבצע גנוטיפ של זבובים בודדים על ידי ניתוח מקטע קטן מהרגל האמצעית שלהם. זבובים שעוברים את קריטריוני הסינון משמשים לאחר מכן לייצור מלאי יציב. כאן, אנו מפרטים את התכנון והבנייה של פלסמידים לעריכת CRISPR ושיטות לסינון ואישור של קווים מהונדסים. יחד, פרוטוקול זה משפר באופן משמעותי את יעילות תיוג הגנים האנדוגניים בדרוזופילה ומאפשר מחקרים של תהליכים תאיים in vivo.
Introduction
חלבונים פלואורסצנטיים התגלו ככלים רבי עוצמה להדמיית לוקליזציה של חלבונים, דינמיקה ואינטראקציות חלבון-חלבון בתאים בתוך אורגניזמים חיים 1,2. תיוג גנים אנדוגניים בחלבונים פלואורסצנטיים מאפשר הדמיה חיה ארוכת טווח של תהליכים תאיים ברזולוציה תת-תאית. יתר על כן, לטכניקות תיוג גנים אנדוגניות אלה יש מספר יתרונות בהשוואה לגישות ביטוי יתר וצביעת חיסון. לדוגמה, ביטוי יתר של חלבונים עלול להוביל לקיפול שגוי של חלבונים, אינטראקציות חלבון-חלבון לא ספציפיות וחוסר לוקליזציה3. עד כה, חוקרים הצליחו ליצור ספריות עצומות של גנים אנדוגניים המאוחים לחלבונים פלואורסצנטיים עבור כמה אורגניזמים לדוגמה, כגון שמרים ניצנים, אשר יכולים לעבור רקומבינציה הומולוגית יעילה4. במקרה של Drosophila melanogaster, כלים שונים כגון MiMICs5, מלכודות משפר מבוסס טרנספוזון6, ו fosmids7 פותחו כדי לתייג גנים פלואורסצנטית.
פיתוח כלים מבוססי CRISPR-Cas9 איפשר לבצע ביעילות עריכת גנום, כולל תיוג חלבונים אנדוגניים, במגוון רחב של אורגניזם מודל 8,9. Cas9 הוא אנזים מונחה רנ”א אשר חותך דנ”א דו-גדילי באופן יעיל וספציפיביותר 8, אשר לאחר מכן ניתן לתקן על ידי מסלול הצטרפות קצה לא הומולוגי (NHEJ) המוביל למוטציות נקודתיות או מחיקות. לחלופין, מסלול תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) מאפשר שילוב של DNA הטרולוגי לתוך הכרומוזום.
שיטות קודמות לתיוג גנים מבוססי קריספר באורגניזם המודל, Drosophila melanogaster, הסתמכו על תהליך דו-שלבי 10,11,12. זה כרוך בשימוש בסמן צבע עיניים מובחן, Dsred, כדי לזהות אירועי HDR מוצלחים. לאחר מכן, סמן Dsred יוסר באמצעות מערכת הרקומבינציה Cre/loxP. כדי לייעל ולזרז את התהליך, אנו מציגים כאן שיטה פשוטה ויעילה יותר. גישה זו עוקפת את הצורך בגנוטיפ קטלני ומאפשרת סריקה ישירה של זבובים בודדים. באופן ספציפי, אנו משתמשים בגישה מבוססת PCR כדי לחלץ דנ”א מקטע קטן של הרגל האמצעית של הזבוב, מה שמאפשר לנו לבצע גנוטיפ של זבובים בודדים. יש לציין כי הליך זה אינו פוגע בחיוניות, בתנועה או ביכולות הרבייה של הזבוב שנדגם. רק האנשים המתאימים, המזוהים בשיטה זו, מתפתחים עוד יותר למניות יציבות.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליצירת חלבון פלואורסצנטי מתויג זבובים שבו גנים אנדוגניים מסומנים עם כתבים פלואורסצנטיים. טכניקה זו משתמשת בעריכת גנום CRISPR-Cas9 כדי להתיך כל תג פלואורופור רצוי למסוף N או C של גן אנדוגני. להלן, אנו מתארים את התכנון והבנייה של פלסמידים gRNA ופלסמיד תורם, אסטרטגיית סינון בצעד אחד לבחירת זבובים חיוביים לקריספר, וצעדים ליצירת קווים יציבים. באופן ספציפי, אנו מתארים אסטרטגיות לתיוג שעון ליבה אנדוגני גן דרוזופילה , נקודה, עם פלואורופור במסוף C. אנו גם מתארים בקצרה את ניסויי הבקרה שיש לבצע כדי לאשר שהחלבון המתויג הוא פונקציונלי וטכניקות הדמיה חיה כדי לדמיין את חלבון המחזור בנוירונים של שעון חי בתוך מוחות דרוזופילה שלמים13. הפרוטוקול המתואר כאן חל באופן נרחב גם על מועמדים לסינון מחיקות והחדרות של פיסות DNA ספציפיות על ידי עריכת גנום CRISPR-Cas9.
Protocol
Representative Results
Discussion
התוצאות מדגימות אסטרטגיה יעילה ופשוטה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה. בפרוטוקול, אנו משתמשים בשני gRNA כדי לגרום לשבירת DNA דו-גדילי ורקומבינציה הומולוגית בצורה יעילה יותר. ה-gRNA והפלסמיד התורם מוזרקים לעוברים של זבובי פירות, המבטאים את האנזים Cas9 בקו הנבט שלהם. עוברי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג’ורג’ ווטאס וג’וזי קלוני על הדיונים בשלבים הראשונים של פיתוח הפרוטוקול. העבודה נתמכה על ידי קרנות מה-NIH (מענק מס’ R35GM133737 ל-S.Y.), מלגת אלפרד פ. סלואן (ל-S. Y.) ו-McKnight Scholar Award (ל-S. Y).
Materials
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
References
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
- Quinones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. 유전학. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. Elife. 5, e12068 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. 유전학. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kanca, O., et al. An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms. Elife. 8, e51539 (2019).
- Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9. Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).
- Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).
- Kanca, O., et al. An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination. Elife. 11, e76077 (2022).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).
- Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila. Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).
- Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region. J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).
