ショウジョウバエのメラノガスターにおける内在性遺伝子タグ付けのためのワンステップCRISPRベースの戦略
Summary
ここでは、成功した遺伝子組み換えをマーカーフリーで識別するためにPCRベースの技術を利用し、安定したノックインラインの開発を促進するショウジョウバエの簡略化された内因性遺伝子タグ付けプロトコルを紹介します。
Abstract
生細胞におけるタンパク質の細胞内局在、動態、および調節の研究は、内因性遺伝子のタグ付けを可能にして蛍光融合タンパク質を産生する技術の出現によって大きく変化しました。これらの方法により、研究者はタンパク質の挙動をリアルタイムで視覚化し、細胞環境内でのタンパク質の機能と相互作用に関する貴重な洞察を得ることができます。現在の多くの遺伝子タグ付け研究では、最初のステップで目の色の変化などの目に見えるマーカーを使用して遺伝子組み換え生物を同定し、2番目のステップで目に見えるマーカーを切除する2段階のプロセスを採用しています。ここでは、ショウ ジョウバエの内因性遺伝子タグを正確かつ迅速に行うためのワンステッププロトコルを提示し、目に見えるアイマーカーなしで操作された系統のスクリーニングを可能にし、従来の方法に比べて大きな利点を提供します。成功した遺伝子タグ付けイベントをスクリーニングするために、PCRベースの技術を採用して、中脚からの小さなセグメントを分析することにより、個々のハエの遺伝子型を決定します。そして、審査基準をクリアしたハエは、安定した資源を生産するために利用されます。ここでは、CRISPR編集プラスミドの設計と構築、および操作されたラインのスクリーニングと確認の方法について詳しく説明します。一緒に、このプロトコルはショウ ジョウバエ の内生遺伝子の分類の効率をかなり改善し、生体内の細胞プロセスの調査を可能にする。
Introduction
蛍光タンパク質は、生体内の細胞におけるタンパク質の局在、動態、およびタンパク質間相互作用を可視化するための強力なツールとして登場しました1,2。内在性遺伝子に蛍光タンパク質をタグ付けすることで、細胞内分解能で細胞プロセスの長期ライブイメージングが可能になります。さらに、これらの内在性遺伝子標識技術には、過剰発現および免疫染色アプローチと比較していくつかの利点があります。例えば、タンパク質の過剰発現は、タンパク質のミスフォールディング、非特異的なタンパク質間相互作用、および局在の誤りにつながる可能性があります3。現在までに、研究者は、効率的な相同組換えを受けることができる出芽酵母などのいくつかのモデル生物について、蛍光タンパク質に融合した内因性遺伝子の膨大なライブラリを作成することができました4。ショウジョウバエの場合、MiMICs5、トランスポゾンベースのエンハンサートラップ6、フォスミド7など、遺伝子を蛍光標識するために様々なツールが考案されている。
CRISPR-Cas9ベースのツールの開発により、幅広いモデル生物において、内在性タンパク質のタグ付けを含むゲノム編集を効率的に行うことが可能になりました8,9。Cas9は、二本鎖DNAを高効率かつ特異的に切断するRNA誘導酵素であり8、その後、点変異または欠失につながる非相同末端結合(NHEJ)経路によって修復することができます。あるいは、相同性指向性修復(HDR)経路により、異種DNAの染色体への組み込みが可能になります。
モデル生物であるショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)におけるCRISPRベースの遺伝子タグ付けの過去の方法は、2段階のプロセスに依存していた10,11,12。これには、識別可能な目の色のマーカーである Dsred を使用して、成功した HDR イベントを検出することが含まれます。その後、Cre/loxP組換えシステムを用いてDsredマーカーを切除します。このプロセスを合理化および迅速化するために、ここでは、よりシンプルで効率的な方法を紹介します。このアプローチにより、致死的なジェノタイピングの必要性が回避され、個々のハエの直接スクリーニングが可能になります。具体的には、PCRベースのアプローチを採用して、ハエの中脚の小さなセグメントからDNAを抽出し、個々のハエの遺伝子型を決定できるようにします。特に、この手順は、サンプリングされたハエの活力、運動、または繁殖能力を損なうことはありません。この方法で特定された適切な個人のみが、安定した株式にさらに開発されます。
ここでは、内因性遺伝子が蛍光レポーターで標識された蛍光タンパク質タグ付きハエを生成するための詳細なプロトコルを紹介します。この技術では、CRISPR-Cas9ゲノム編集を使用して、任意の蛍光色素タグを内因性遺伝子のN末端またはC末端に融合させます。以下では、gRNAプラスミドとドナープラスミドの設計と構築、CRISPR陽性ハエを選択するためのワンステップスクリーニング戦略、および安定した系統を確立するためのステップについて説明します。具体的には、内在性コアクロックのショウジョウバエ遺伝子periodをC末端の蛍光色素でタグ付けする戦略について述べる。また、タグ付けされたタンパク質が機能的であることを確認するために実施する必要がある対照実験と、無傷のショウジョウバエ脳内のライブクロックニューロンの周期タンパク質を視覚化するためのライブイメージング技術についても簡単に説明します13。ここで説明するプロトコルは、CRISPR-Cas9ゲノム編集によるDNAの特定のビットの欠失および挿入の候補をスクリーニングするためにも広く適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この結果は、 ショウジョウバエの内在性遺伝子にタグを付けるための、合理化されたシンプルなワンステップCRISPRベースの戦略を示しています。プロトコルでは、2つのgRNAを使用して、DNA二本鎖切断と相同組換えをより効率的に誘導します。gRNAとドナープラスミドをショウジョウバエの胚に注入し、ショウジョウバエの胚は生殖細胞系でCas9酵素を発現します。これらの胚は、その後?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
プロトコル開発の初期段階で議論してくれたGeorge Watase氏とJosie Clowney氏に感謝します。この研究は、NIH(助成金番号R35GM133737、Alfred P. Sloan Fellowship(S.Y.)、McKnight Scholar Award(S.Y.)からの資金によって支援されました。
Materials
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
References
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
- Quinones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. 유전학. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. Elife. 5, e12068 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. 유전학. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kanca, O., et al. An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms. Elife. 8, e51539 (2019).
- Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9. Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).
- Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).
- Kanca, O., et al. An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination. Elife. 11, e76077 (2022).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).
- Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila. Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).
- Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region. J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).
