Estratégia baseada em CRISPR em uma etapa para marcação gênica endógena em Drosophila melanogaster
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo simplificado de marcação gênica endógena para Drosophila, que utiliza uma técnica baseada em PCR para identificação livre de marcadores de modificações genéticas bem-sucedidas, facilitando o desenvolvimento de linhagens estáveis.
Abstract
O estudo da localização, dinâmica e regulação de proteínas subcelulares em células vivas tem sido profundamente transformado pelo advento de técnicas que permitem a marcação de genes endógenos para produzir proteínas de fusão fluorescente. Esses métodos permitem que os pesquisadores visualizem o comportamento das proteínas em tempo real, fornecendo informações valiosas sobre suas funções e interações dentro do ambiente celular. Muitos estudos atuais de marcação genética empregam um processo de duas etapas em que marcadores visíveis, como alterações na cor dos olhos, são usados para identificar organismos geneticamente modificados na primeira etapa, e o marcador visível é excisado na segunda etapa. Aqui, apresentamos um protocolo de uma etapa para realizar marcação gênica endógena precisa e rápida em Drosophila melanogaster, que permite a triagem de linhagens projetadas sem o marcador ocular visível, oferecendo uma vantagem significativa em relação aos métodos anteriores. Para rastrear eventos bem-sucedidos de marcação genética, empregamos uma técnica baseada em PCR para genotipar moscas individuais analisando um pequeno segmento de sua perna média. As moscas que passam nos critérios de triagem são então usadas para produzir estoques estáveis. Aqui, detalhamos o projeto e a construção de plasmídeos de edição CRISPR e métodos para triagem e confirmação de linhas de engenharia. Em conjunto, este protocolo melhora significativamente a eficiência da marcação gênica endógena em Drosophila e possibilita estudos de processos celulares in vivo.
Introduction
As proteínas fluorescentes têm emergido como poderosas ferramentas para visualizar a localização, a dinâmica e as interações proteína-proteína em células de organismos vivos 1,2. A marcação de genes endógenos com proteínas fluorescentes permite imagens ao vivo de longo prazo de processos celulares com resolução subcelular. Além disso, essas técnicas endógenas de marcação gênica apresentam diversas vantagens em relação às abordagens de superexpressão e imunomarcação. Por exemplo, a superexpressão de proteínas pode levar a enovelamento incorreto de proteínas, interações proteína-proteína inespecíficas e localização incorreta3. Até o momento, os pesquisadores conseguiram criar vastas bibliotecas de genes endógenos fundidos a proteínas fluorescentes para alguns organismos modelo, como leveduras em brotamento, que podem sofrer eficiente recombinação homóloga4. No caso de Drosophila melanogaster, várias ferramentas, como MiMICs5, armadilhas intensificadoras baseadas em transposon6 e fosmidas7, foram desenvolvidas para marcar genes fluorescentemente.
O desenvolvimento de ferramentas baseadas em CRISPR-Cas9 tornou possível realizar eficientemente a edição do genoma, incluindo a marcação de proteínas endógenas, em uma ampla gama de organismos modelo 8,9. Cas9 é uma enzima guiada por RNA que cliva DNA de fita dupla de maneira altamente eficiente e específica8, que pode então ser reparada por uma via de junção final não homóloga (NHEJ) levando a mutações pontuais ou deleções. Alternativamente, a via de reparo dirigido por homologia (HDR) permite a integração do DNA heterólogo no cromossomo.
Métodos anteriores para marcação gênica baseada em CRISPR no organismo modelo, Drosophila melanogaster, basearam-se em um processo de duas etapas 10,11,12. Isso envolve o uso de um marcador de cor de olho discernível, Dsred, para detectar eventos HDR bem-sucedidos. Posteriormente, o marcador Dsred seria excisado usando o sistema de recombinação Cre/loxP. Para agilizar e agilizar esse processo, apresentamos aqui um método mais simples e eficiente. Essa abordagem contorna a necessidade de genotipagem letal e permite a triagem direta de moscas individuais. Especificamente, empregamos uma abordagem baseada em PCR para extrair DNA de um pequeno segmento da perna média da mosca, permitindo-nos genotipar moscas individuais. Notavelmente, este procedimento não compromete a vitalidade, o movimento ou as capacidades reprodutivas da mosca amostrada. Apenas os indivíduos apropriados, identificados através deste método, são desenvolvidos em estoques estáveis.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para geração de moscas marcadas com proteínas fluorescentes em que genes endógenos são marcados com repórteres fluorescentes. Esta técnica usa a edição do genoma CRISPR-Cas9 para fundir qualquer etiqueta de fluoróforo desejada ao terminal N- ou C- de um gene endógeno. Abaixo, descrevemos o projeto e a construção de plasmídeos de gRNA e de um plasmídeo doador, a estratégia de triagem em uma etapa para selecionar moscas CRISPR-positivas e as etapas para estabelecer linhagens estáveis. Especificamente, descrevemos estratégias para marcar um gene endógeno do relógio central Drosophila, ponto, com um fluoróforo no C-terminal. Também descrevemos brevemente os experimentos de controle que precisam ser realizados para confirmar que a proteína marcada é funcional e técnicas de imagem ao vivo para visualizar a proteína Period em neurônios de relógio vivos dentro de cérebros intactos de Drosophila 13. O protocolo descrito aqui também é amplamente aplicável para selecionar candidatos para deleções e inserções de pedaços específicos de DNA por edição do genoma CRISPR-Cas9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os resultados demonstram uma estratégia simplificada e simples baseada em CRISPR de uma etapa para marcar genes endógenos em Drosophila. No protocolo, usamos dois gRNAs para induzir a quebra da fita dupla do DNA e a recombinação homóloga de forma mais eficiente. Os gRNAs e o plasmídeo doador são injetados em embriões de moscas-das-frutas, que expressam a enzima Cas9 em sua linha germinativa. Esses embriões são posteriormente cultivados em condições padrão até a idade adulta, quando são cruzados co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a George Watase e Josie Clowney pelas discussões durante os estágios iniciais de desenvolvimento do protocolo. O trabalho foi apoiado por fundos do NIH (grant no. R35GM133737 para S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (para S. Y.) e McKnight Scholar Award (para S. Y.).
Materials
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
References
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