이 프로토콜은 팔미트산 유발 시험관 내 모델에서 비알코올성 지방간 질환에 대한 platycodin D의 보호 효과를 조사합니다.
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방법 논문
Palmitic Acid-Induced In Vitro 모델에서 비알코올성 지방간 질환에 대한 Platycodin D의 보호 효과 조사
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 발생은 전 세계적으로 놀라운 속도로 증가하고 있습니다. Platycodon grandiflorum 은 다양한 질병의 치료를위한 전통적인 민족 의학으로 널리 사용되며 일상 식단에 포함될 수있는 대표적인 기능성 식품입니다. 연구에 따르면 Platycodon grandiflorum의 주요 활성 성분 중 하나인 platycodin D(PD)는 생체이용률이 높고 NAFLD의 진행을 크게 완화하지만 이에 대한 기본 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 본 연구는 시험관 내에서 NAFLD에 대한 PD의 치료 효과를 조사하는 것을 목적으로 한다. AML-12 세포는 시험관 내에서 NAFLD를 모델링하기 위해 24시간 동안 300μM 팔미트산(PA)으로 전처리되었습니다. 이어서, 세포를 PD로 처리하거나 24시간 동안 PD 치료를 받지 않았다. 활성 산소종(ROS)의 수준은 2′,7′-디클로로-디하이드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 염색을 사용하여 분석되었으며, 미토콘드리아 막 전위는 JC-1 염색 방법으로 측정되었습니다. 또한, 세포 용해물에서 LC3-II/LC3-I 및 p62/SQSTM1의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. PD는 대조군에 비해 PA 처리군에서 ROS 및 미토콘드리아 막 전위 수준을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다. 한편, PD는 대조군에 비해 PA 처리군에서 LC3-II/LC3-I 수준을 증가시키고 p62/SQSTM1 수준을 감소시켰습니다. 결과는 PD가 산화 스트레스를 줄이고 자가포식을 자극하여 시험관 내에서 NAFLD를 개선한다는 것을 나타냅니다. 이 시험관 내 모델은 NAFLD에서 PD의 역할을 연구하는 데 유용한 도구입니다.
서론
Platycodon grandiflorus (PG)는 Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC.는 중국 전통 의학(TCM)에서 사용됩니다. 주로 중국의 북동부, 북부, 동부, 중부 및 남서부 지역에서 생산됩니다1. PG 성분에는 트리테르페노이드 사포닌, 다당류, 플라보노이드, 폴리페놀, 폴리에틸렌 글리콜, 휘발성 오일 및 미네랄이 포함됩니다2. PG는 아시아에서 식품 및 약초로 사용되어 온 오랜 역사를 가지고 있습니다. 전통적으로이 약초는 폐 질환에 대한 약을 만드는 데 사용되었습니다. 현대 약리학은 또한 다른 질병을 치료하기 위한 PG의 효능에 대한 증거를 제공합니다. 연구에 따르면 PG는 다양한 약물 유발 간 손상 모델에서 치료 효과가 있습니다. PG 또는 platycodin 추출물의 식이 보충제는 고지방 식단으로 인한 비만 및 관련 대사 질환을 개선할 수 있습니다 3,4,5. PG의 다당류는 생쥐의 LPS/D-GalN에 의한 급성 간 손상 치료에 사용할 수 있다
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프로토콜
AML-12 세포(정상 마우스 간세포 세포주)는 세포 기반 연구에 사용됩니다. 세포는 상업적 공급원으로부터 얻어진다 ( 재료 표 참조).
1. 시험관 내에서 NAFLD를 모델링하기 위한 AML-12 세포의 전처리
- 세포를 정상 세포 배양 배지 (0.005 mg/mL 인슐린, 5 ng/mL 셀레늄, 0.005 mg/mL 트랜스페린, 40 ng/mL 덱사메타손, 및 10% 소 태아 혈청 [FBS]를 함유하는 DMEM 플러스 Ham's F12 [1:1], 재료 표 참조)를 5%CO2로 가습된 분위기에서 37°C로 유지한다.
- 2.8 x 105 cells/well의 밀도로 12웰 플레이트(1mL/well)에 세포를 시딩합니다.
참고: 모든 세포 분해 및 배지 교환 작업은 세포 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다. - 하룻밤 배양(~10시간) 후 세포의 배양 배지를 제거한 다음 1mL의 무혈청 배지(웰당)로 세포를 두 번 세척합니다.
- 12웰 세포 플레이트를 (1) 대조군, (2) PD 처리군, (3) PA 처리군, (4....
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결과
세포의 세포 내 ROS
AML-12 세포를 24시간 동안 300μM PA로 유도하고 NAFLD 세포 모델을 확립했습니다. 이어서, 세포를 24시간 동안 PD로 처리하였다. 세포를 DCFH-DA 형광 프로브로 표지하고, 형광현미경으로 ROS 생성을 관찰하였다. 세포내 ROS의 DCFH-DA 염색 결과를 도 1에 나타내었다. 결과는 PD가 300μM의 PA(P < 0.01)로 배양된 세포에서 세포내 ROS 수준을 유의하게 감소시킬 수 있음을 보여주었으며, 이는 PD가 세포 산화 스트레스를 감소시킬 수 있음을 나타냅니다.
세포의 미토콘드리아 막 전위
미토콘드리아는 내인성 세포 사멸 경로48,49,50
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토론
연구에 따르면 NAFLD는 지방간에서 NASH에 이르는 임상 병리학 적 증후군으로 간경변 및 간암으로 진행될 수 있습니다51. 고지방 식단과 비활동적인 생활 방식은 NAFLD의 전형적인 위험 요소입니다. NAFLD 치료를 위한 비약물 요법과 약물 요법 모두 연구되었다51,52,53. 그러나 NAFLD의 발병기전은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 여기에 설명된 방법은 PA 자극 AML-12 세포에 의해 확립된 NAFLD의 시험관내 모델을 포함합니다. 우리는 이 모델에서 NAFLD에 대한 PD의 보호 효과를 조사했으며 PD가 PA에 의해 유도된 ROS 증가를 약화시킨다는 것을 발견했습니다. 게다가, PD는 또한 PA에 의해 유도된 MMP 탈분극을 개선하였다. 또한, PD는 p62의 단백질 발현 수준을 현저히 감소.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 충칭 과학 기술위원회 (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 및 jbky20210029)와 중국 박사후 과학 재단 (No. 2021MD703919)의 보조금으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5% BSA 차단 완충액 | Solarbio, 베이징, 중국 | SW3015 | |
| AML12(알파 마우스 간 12) 세포주 | Procell Life Science& Technology Co., Ltd, 중국 | AML12 | |
| Beyo ECL 플러스 | Beyotime, 상하이, 중국 | P0018S | |
| 바이오 안전 캐비닛 | Esco Micro Pte Ltd, 싱가포르 | AC2-5S1 A2 | |
| cellSens | Olympus, Tokyo, Japan | 1.8 | |
| Culture CO2 Incubator | Esco Micro Pte Ltd, 싱가포르 | CCL-170B-8 | |
| Dexamethasone | Beyotime, Shanghai, China | ST125 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio, Beijing, China | D8371 | |
| DMEM/F12 | Hyclone, 로건, 유타, 미국 | SH30023.01 | |
| Foetal Bovine Serum | Hyclone, Tauranga, New Zealand | SH30406.05 | |
| GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | 8.0 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | ABclonal, Wuhan, China | AS003 | |
| Hydrophobic PVDF Transfer Membrane | Merck, Darmstadt, Germany | IPFL00010 | |
| 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 용액, 100회; | Beyotime, 상하이, 중국 | C0341 | |
| MAP LC3β 항체 | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-376404 | |
| JC-1 | Solarbio, Beijing, China | M8650 | |
| Olympus 도립 현미경 IX53 | Olympus, Tokyo, Japan | IX53 | |
| 팔미트산 | 시그마, 독일 | P0500 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액(100x) | 하이클론, 로건, 유타, 미국 | SV30010 | |
| 페닐메탄설포닐 불소 | Beyotime, 상하이, 중국 | ST506 | |
| 인산염 완충 용액 | Hyclone, 로건, 유타, USA | BL302A | |
| Platycodin D | Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, 중국 | CSA: 58479-68-8 | |
| 범용 프로테아제 억제제 칵테일, 100x | Beyotime, 상하이, 중국 | P1005 | |
| 단백질 마커 | Solarbio, 베이징, 중국 | PR1910 | |
| 반응성 산소 종 분석 키트 | Solarbio, 베이징, 중국 | CA1410 | |
| 리파 리시스 버퍼 | Beyotime, 상하이, 중국 | P0013E | |
| SDS-PAGE 젤 빠른 준비 키트 | Beyotime, 상하이, 중국 | P0012AC | |
| SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼, 5x | Beyotime, 상하이, 중국 | P0015 | |
| 시그마 원심분리기 | 독일 | 3K15 | |
| SQSTM1/p62 항체 | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-28359 | |
| 테칸 인피니트 200 PRO | Tecan Austria GmbH, 오스트리아 | 1510002987 | |
| WB Transfer Buffer,10x | Solarbio, Beijing, China | D1060 | |
| β-Actin Mouse mAb | ABclonal, 우한, 중국 | AC004 |
참고문헌
- Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
- Ma, X., et al.
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