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의학

パルミチン酸誘発 In vitro モデルにおける非アルコール性脂肪性肝疾患に対するプラチコジンDの保護効果の調査

Published: December 02, 2022
doi:
10.3791/64816
, , , , , , ,
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University

Summary

このプロトコルは、パルミチン酸誘発 インビトロ モデルにおける非アルコール性脂肪肝疾患に対するプラチコジンDの保護効果を調査します。

Abstract

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の発生は、世界中で驚くべき速度で増加しています。 プラティコドングランディフロラム は、さまざまな病気の治療のための伝統的な民族医学として広く使用されており、毎日の食事に組み込むことができる典型的な機能性食品です。研究によると、プラ ティコドングランディフロラムの主要な有効成分の1つであるプラチコジンD(PD)は、バイオアベイラビリティが高く、NAFLDの進行を大幅に緩和することが示唆されていますが、その根本的なメカニズムはまだ不明です。この研究は、 インビトロでのNAFLDに対するPDの治療効果を調査することを目的としています。AML-12細胞を300μMパルミチン酸(PA)で24時間前処理し、 in vitroでNAFLDをモデル化した。次いで、細胞をPDで処理するか、または24時間PD処理を受けなかった。活性酸素種(ROS)を2′,7′-ジクロロ-ジヒドロ-フルオレセインジアセテート(DCFH-DA)染色を用いて分析し、ミトコンドリア膜電位をJC-1染色法により決定した。さらに、細胞ライセート中のLC3-II/LC3-Iおよびp62/SQSTM1のタンパク質発現レベルをウェスタンブロッティングにより解析した。PDは、対照群と比較して、PA治療群におけるROSおよびミトコンドリア膜電位レベルを有意に低下させることがわかった。一方、PDは、対照群と比較して、PA治療群でLC3-II / LC3-Iレベルを上昇させ、p62 / SQSTM1レベルを低下させました。結果は、PDが酸化ストレスを軽減し、オートファジーを刺激することによってin vitro でNAFLDを改善することを示しました。この インビトロ モデルは、NAFLDにおけるPDの役割を研究するための有用なツールです。

Introduction

プラティコドングランディフロラス(PG)、プラティコドングランディフロラス(Jacq)の乾燥根です。A.DC.は、伝統的な漢方薬(TCM)で使用されています。主に中国の北東部、北部、東部、中部、南西部で生産されています1。PG成分としては、トリテルペノイドサポニン、多糖類、フラボノイド、ポリフェノール、ポリエチレングリコール、揮発油、ミネラル2などが挙げられる。PGは、アジアで食品や漢方薬として使用されてきた長い歴史があります。伝統的に、このハーブは肺疾患に対する薬を作るために使用されていました。現代の薬理学はまた、他の疾患を治療するためのPGの有効性の証拠を提供する。研究によると、PGはさまざまな薬物誘発性肝障害モデルに治療効果があることが示されています。PGまたはプラチコジン抽出物の栄養補助食品は、高脂肪食誘発性肥満およびそれに関連する代謝性疾患を改善することができます3,4,5。PG由来の多糖類は、マウスのLPS/D-GalNによって引き起こされる急性肝障害の治療に使用できます6。さらに、PGの根からのサポニンは、高脂肪食誘発性非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を改善します7。さらに、PGの最も重要な治療成分の1つであるプラチコジンD(PD)は、ヒト肝細胞癌(HepG2)細胞における低密度リポタンパク質受容体の発現および低密度リポタンパク質の取り込みを増強することができる8。さらに、PDはまた、アポトーシスを誘導し、HepG2細胞における接着、遊走、および浸潤を阻害することができる9,10。したがって、この研究では、マウス肝癌AML-12細胞を使用してin vitroモデルを構築し、このモデルにおけるPDの薬理学的効果と根底にあるメカニズムをさらに研究します。

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)という用語は、単純性脂肪症、NASH、肝硬変、および肝細胞癌を含む肝疾患のグループを指す11。NAFLDの病因は不完全に理解されていますが、古典的な「ツーヒット」理論から現在の「マルチヒット」理論まで、インスリン抵抗性はNAFLDの病因の中心であると考えられています12,13,14。研究によると、肝細胞のインスリン抵抗性は遊離脂肪酸の増加につながり、肝臓に沈着して肝臓を脂肪にするトリグリセリドを形成します15,16。脂肪の蓄積は、脂肪毒性、酸化ストレス誘発性ミトコンドリア機能障害、小胞体ストレス、および炎症性サイトカイン放出を引き起こし、NAFLDの病因と進行を引き起こす可能性があります17,18。さらに、オートファジーは、細胞のインスリン感受性、細胞脂質代謝、肝細胞損傷、および自然免疫の調節に関与しているため、NAFLDの病因にも役割を果たします19,20,21。

NAFLD22,23の病因および潜在的な治療標的を探索するための基礎を提供するために、様々な動物モデルおよび細胞モデルが確立されている。ただし、単一の動物モデルは、NAFLD24のすべての病理学的プロセスを完全に模倣することはできません。動物間の個人差は異なる病理学的特徴をもたらす。NAFLDのin vitro研究で肝細胞株または初代肝細胞を使用すると、実験条件で最大の一貫性が保証されます。肝脂質代謝調節不全は、NAFLD25における肝細胞脂質液滴蓄積のレベルを高める可能性があります。オレイン酸やパーム油などの遊離脂肪酸は、高脂肪食によって引き起こされるNAFLDを模倣するためにin vitroモデルで使用されています26,27。ヒト肝芽腫細胞株HepG2は、in vitroでのNAFLDモデルの構築によく使用されますが、腫瘍細胞株として、HepG2細胞の代謝は、通常の生理学的条件下での肝細胞の代謝とは大きく異なります28。したがって、初代肝細胞またはマウス初代肝細胞を使用して薬物スクリーニングのためのin vitro NAFLDモデルを構築することは、腫瘍細胞株を使用するよりも有利である。動物モデルとin vitro肝細胞モデルの両方での薬物効果と治療標的の相乗的検討を比較すると、マウス肝細胞を使用してin vitro NAFLDモデルを構築する方が、より良い応用の可能性を秘めているようです。

肝臓に入る遊離脂肪酸は酸化されてエネルギーを生成するか、トリグリセリドとして貯蔵されます。重要なことに、遊離脂肪酸は特定の脂肪毒性を有し、細胞機能障害およびアポトーシスを誘発し得る12。パルミチン酸(PA)は、ヒト血漿中に最も豊富に存在する飽和脂肪酸である29。非脂肪組織の細胞が高濃度のPAに長時間さらされると、これは活性酸素種(ROS)の産生を刺激し、酸化ストレス、脂質蓄積、さらにはアポトーシスを引き起こします30。したがって、多くの研究者は、肝細胞を刺激してROSを産生するための誘導因子としてPAを使用し、したがって、in vitro脂肪肝疾患モデルを構築し、細胞に対する特定の活性物質の保護効果を評価します31、32、33、34。この研究では、PAによって誘導されるNAFLDの細胞モデルに対するPDの保護効果を調査するためのプロトコルを紹介します。

Protocol

AML-12細胞(正常マウス肝細胞株)は、細胞ベースの研究に使用されます。セルは市販の供給源から入手されます( 材料表を参照)。 1. AML-12細胞をin vitroでNAFLDをモデル化するための前処理 正常な細胞培養培地(DMEMとハムのF12 [1:1]0.005 mg/mLインスリン、5 ng/mLセレン、0.005 mg/mLトランスフェリン、40 ng/mLデキサメタゾン、および10%ウシ胎児血?…

Representative Results

細胞内の細胞内ROSAML-12細胞を300 μM PAで24時間誘導し、NAFLD細胞モデルを確立しました。続いて、細胞をPDで24時間処理した。細胞をDCFH-DA蛍光プローブで標識し、ROS産生を蛍光顕微鏡下で観察した。細胞内の細胞内ROSのDCFH-DA染色の結果を 図1に示す。結果は、PDが300μMのPA(P < 0.01)でインキュベートされた細胞の細胞内ROSのレベルを大幅に低下させるこ?…

Discussion

研究は、NAFLDが脂肪肝からNASHに至るまでの臨床病理学的症候群であり、肝硬変および肝臓癌に進行する可能性があるという事実を強調しています51。高脂肪食と非アクティブなライフスタイルは、NAFLDの典型的な危険因子です。NAFLD治療のための非薬物療法と薬物療法の両方が研究されています51,52,53。し?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、重慶科学技術委員会(cstc2020jxjl-jbky10002、jbky20200026、cstc2021jscx-dxwtBX0013、およびjbky20210029)および中国ポスドク科学基金会(No.2021MD703919)からの助成金によってサポートされています。

Materials

5% BSA Blocking Buffer Solarbio, Beijing, China SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China AML12
Beyo ECL Plus Beyotime, Shanghai, China P0018S
Bio-safety cabinet Esco Micro Pte Ltd, Singapore AC2-5S1 A2 
cellSens Olympus, Tokyo, Japan 1.8
Culture CO2 Incubator Esco Micro Pte Ltd, Singapore CCL-170B-8
Dexamethasone Beyotime, Shanghai, China ST125
Dimethyl sulfoxide Solarbio, Beijing, China D8371
DMEM/F12 Hyclone, Logan, UT, USA SH30023.01
Foetal Bovine Serum Hyclone, Tauranga, New Zealand SH30406.05
Graphpad software GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA 8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) ABclonal, Wuhan, China AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane Merck, Darmstadt, Germany IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× Beyotime, Shanghai, China C0341
MAP LC3β Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 Solarbio, Beijing, China M8650
Olympus Inverted Microscope IX53 Olympus, Tokyo, Japan IX53
Palmitic Acid Sigma, Germany P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) Hyclone, Logan, UT, USA SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride Beyotime, Shanghai, China ST506
Phosphate Buffered Solution Hyclone, Logan, UT, USA BL302A
Platycodin D Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x Beyotime, Shanghai, China P1005
Protein Marker Solarbio, Beijing, China PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit Solarbio, Beijing, China CA1410
RIPA Lysis Buffer Beyotime, Shanghai, China P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit Beyotime, Shanghai, China P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x Beyotime, Shanghai, China P0015
Sigma Centrifuge Sigma, Germany 3K15
SQSTM1/p62 Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
WB Transfer Buffer,10x Solarbio, Beijing, China D1060
β-Actin Mouse mAb ABclonal, Wuhan, China AC004
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Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., Chen, Y., Xing, Y., Li, N., Wang, G. Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model. J. Vis. Exp. (190), e64816, doi:10.3791/64816 (2022).
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