Summary
Her brukes intraperitoneal injeksjon av leukemiceller for å etablere og forplante akutt myelogen leukemi (AML) hos mus. Denne nye metoden er effektiv i seriell transplantasjon av AML-celler og kan tjene som et alternativ for de som kan oppleve vanskeligheter og inkonsekvenser med intravenøs injeksjon hos mus.
Abstract
Det er et udekket behov for nye terapier for å behandle akutt myelogen leukemi (AML) og tilhørende tilbakefall som involverer vedvarende leukemi stamceller (LSCs). En eksperimentell AML-gnagermodell for å teste terapier basert på vellykket transplantasjon av disse cellene via retro-orbitale injeksjoner hos mottakermus er full av utfordringer. Målet med denne studien var å utvikle en enkel, pålitelig og konsistent metode for å generere en robust murine modell av AML ved hjelp av en intraperitoneal rute. I denne protokollen ble benmargsceller transdusert med et retrovirus som uttrykker humant MLL-AF9-fusjonsonkoprotein. Effektiviteten av populasjoner av lineage negative (Lin-) og Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) som donor-LSC i utviklingen av primær AML ble testet, og intraperitoneal injeksjon ble tatt i bruk som en ny metode for å generere AML. Sammenligning mellom intraperitoneale og retroorbitale injeksjoner ble gjort i serietransplantasjoner for å sammenligne og kontrastere de to metodene. Både Lin- og LSK-celler transducert med humant MLL-AF9-virus innpodet godt i benmarg og milt hos mottakere, noe som førte til en fullblåst AML. Intraperitoneal injeksjon av donorceller etablerte AML hos mottakere ved serietransplantasjon, og infiltrasjon av AML-celler ble påvist i blod, benmarg, milt og lever hos mottakere ved flowcytometri, qPCR og histologiske analyser. Dermed er intraperitoneal injeksjon en effektiv metode for AML-induksjon ved bruk av seriell transplantasjon av donor leukemiske celler.
Introduction
Akutt myelogen leukemi (AML) er en type hematologisk malignitet av ulik etiologi med dårlig prognose1. Genereringen av AML-dyremodeller legger grunnlaget for forståelsen av dens komplekse variasjoner og patobiologi i et forsøk på å oppdage nye terapier2. Leukemogenese hos mus involverer transplantasjon av donorceller som uttrykker fusjonsonkoproteiner, inkludert fusjoner som involverer genet blandet avstamningsleukemi (MLL) for å indusere AML, for å etterligne sykdommen hos mennesker3. Ulike cellulære opprinnelser av donorceller har blitt rapportert ved transplantasjon av MLL-genassosiert AML4, med svært lite kjent om cellene som er ansvarlige for sykdommens opprinnelse.
Flere ruter er utviklet for transplantasjon hos mus; I stedet for en intrafemoral injeksjon, som direkte introduserer mutante donorceller i benmarg5, har en intravenøs injeksjon som benytter venøs sinus plexus, hale vene og jugularvenen blitt mye brukt til å generere murine AML-modeller 6,7,8,9. Når det gjelder retro-orbital (r.o.) injeksjon, har ulike iboende ulemper, som volumbegrensning, høy teknisk etterspørsel, få sjanser for gjentatte forsøk eller feil, og potensielle okulære skader, vært store snublesteiner med begrensede eller ingen levedyktige alternativer7. Tail vein injeksjon kan ha lignende problemer i tillegg til lokale skader; For å lette prosedyren, må mus ofte varmes opp for å utvide haleårene10. Det er også vanskelig å lokalisere halevenen uten en ekstra lyskilde, spesielt i C57BL/6-stammen til mus. For jugularveneinjeksjon krever forskningspersonell tilstrekkelig trening for å lokalisere venen og begrense mulige komplikasjoner. I tillegg må både venøs sinus og jugularveninjeksjoner utføres under anestesi, noe som legger til et annet nivå av kompleksitet. Det er derfor fristende å utforske nye transplantasjonsveier for å lette etableringen av AML-murinmodeller.
Intraperitoneal (i.p.) injeksjon brukes ofte til å administrere medisiner, fargestoffer og anestetika 11,12,13,14,15; Det har også blitt brukt til å introdusere hematopoietiske celler for ektopisk hematopoiesis16 og å transplantere benmargsavledede mesenkymale stamceller i forskjellige musemodeller 17,18,19,20,21. Det har imidlertid blitt sjelden brukt til å etablere hematopoietiske maligniteter hos mus, spesielt for å studere AML sykdomsprogresjon.
Denne studien beskriver gjennomførbarheten av i.p. injeksjon i genereringen av AML-musemodeller, i tillegg til å sammenligne transplantasjonseffektiviteten av avstamningsnegative (Lin-) og Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) populasjoner som donorceller. Disse funnene gir en enkel og effektiv måte å generere eksperimentelle modeller av AML og relaterte myelogen leukemier. En slik metode har potensial til å fremme vår forståelse av sykdomsmekanismene, samt gi en relativt enkel modell for å teste eksperimentelle terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble forhåndsgodkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Pennsylvania State University.
1. Fremstilling av buffere og reagenser
- Forbered ampicillin supplert (AP) LB agarplater (sterile 10 cm plater). For å gjøre dette, oppløs 10 g LB-buljong med agar i 400 ml destillert vann, rør og bring volumet opp til 500 ml. Steriliser oppløsningen ved autoklavering, la deretter oppløsningen avkjøles, tilsett 0,5 ml ampicillin (lager: 150 mg/ml) i oppløsningen og rist den for å blande. Tilsett umiddelbart 18 ml oppløsning til en steril 10 cm plate i nærheten av en alkohollampe, la den stivne ved romtemperatur, og oppbevar platene opp ned ved 4 °C inntil videre bruk.
- Forbered LB-medier ved å løse opp 10 g LB uten agar i 500 ml destillert vann. Steriliser løsningen ved autoklavering, la løsningen avkjøles, tilsett 0,5 ml ampicillin (lager: 150 mg / ml) i oppløsning, og rist den for å blande.
- Forbered strømningsbuffer ved å tilsette 5 ml penicillin / streptomycin og 10 ml varmeinaktivert føtal bovint serum (hiFBS) i 485 ml 1x Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS).
MERK: For å deaktivere FBS ved oppvarming, plasser tinte FBS-flasker i et vannbad på 56 °C. Forsikre deg om at flaskene ikke velter eller på annen måte blir nedsenket i vannbadet. Temperaturen er kritisk for fullstendig nedbrytning; For å sikre dette, vent til temperaturen stabiliserer seg på 56 °C etter at flaskene er satt i vannbadet. Roter flaskene forsiktig hvert 10. minutt tre ganger. Ikke la serumet ruge i mer enn 30 minutter. - Forbered vedlikeholdsmedier ved å tilsette 50 ml hiFBS, 5 ml L-glutamin og 5 ml penicillin / streptomycin i 440 ml Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM). Forbered transfeksjonsmedier ved å tilsette 50 ml hiFBS og 5 ml L-glutamin i 445 ml DMEM-medier.
- Forbered røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer ved å tilsette 4,145 g NH4Cl, 0,504 g NaHCO3 og 16,81 mg etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 500 ml destillert vann. Forbered ufullstendig Iscoves modifiserte Dulbecco's medium (IMDM) media ved å tilsette 75 ml hiFBS, 5 g bovint serumalbumin (BSA), 0,5 ml 10 mg/ml insulin, 2,5 ml 4 mg/ml holo-transferrin, 3,5 μl β-merkaptoetanol, 5 ml L-glutamin og 0,5 ml ciprofloksacin i 416,5 ml IMDM-medier.
- Forbered 10 ml 2x IMDM-medier, hvor konsentrasjonen av cytokiner er dobbelt så mye i 1x IMDM-medier, ved å tilsette 10 μL 50 ng / μL mr-SCF, 20 μL av 25 ng / μL mr-Flt3L, 20 μL av 10 ng / μL mr-IL-6, 20 μL av 10 ng / μL mr-IL-3, 10 μL av 10 mg / ml insulin, og 50 mikrol 4 mg/ml holotransferrin til 9,87 ml ufullstendige IMDM-medier.
MERK: Kontroller at flytbuffer, RBC-lysebuffer, vedlikeholdsmedier, transfeksjonsmedier og ufullstendige IMDM-medier er filtersterilisert før bruk.
2. Plasmid transformasjon
- Tine 20 μL α-Select kompetente celler på is. Tilsett 1 μL (~2 ng) MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plasmid22 til tinte kompetente celler og bland forsiktig ved å banke på røret. Inkuber reaksjonen på is i 30 minutter.
- Varme sjokk blandingen ved inkubering i 40 s i en 42 ° C varmeblokk. Overfør umiddelbart røret på is i 2 minutter.
- Tilsett 1 ml LB-medier (uten ampicillin) i røret og rist ved 37 °C og 200 rpm i 1 time.
- Sentrifuger røret ved romtemperatur ved 500 x g i 4 minutter og kast 0,9 ml supernatant. Hør bunnfallet godt i de resterende 0,1 ml LB-mediene.
- Spre de transformerte kompetente cellene på forvarmede (37 ° C) AP LB agarplater. Inkuber platen opp ned ved 37 °C i 12-16 timer.
- Velg en enkelt koloni og bruk de transformerte cellene i 10 ml AP LB-medier over natten ved 37 °C og 200 o / min.
- Tilsett 5 ml brukte transformerte kompetente celler til 500 ml AP LB-medier i en kolbe og inkuber kolben over natten ved 37 °C og 200 o / min.
- Trekk ut plasmidet ved hjelp av et plasmidekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner og resuspender i 0,5 ml autoklavert ultrarent vann. Kvantifiser plasmidet ved hjelp av et spektrofotometer.
3. Transfeksjon av Phoenix økotrope (pECO) celler
- Dyrkning 2 x 106 pECO-celler/plate i vedlikeholdsmedier i 10 cm plater i en fuktet 5 % CO2 -inkubator ved 37 °C. Sørg for at pECO-cellene opprettholdes i eksponentiell vekstfase og aktivt deler seg før passasje.
- Når cellene blir 80% sammenflytende, vask platene med 5 ml DPBS to ganger, tilsett 1 ml trypsin på platen og inkuber i en fuktet 5% CO 2 -inkubator ved 37 ° C i2 minutter. Høst cellene med 5 ml vedlikeholdsmedier i et sterilt 15 ml rør og sentrifuge ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter. Resuspender cellepelleten i 5 ml vedlikeholdsmedier.
- Bland 10 μL cellesuspensjon og 10 μL trypanblå og legg 10 μL på et hemocytometer for å telle cellene.
Totalt antall celler/ml = (Totalt antall celler telt x Fortynningsfaktor x 104 celler/ml)/ Antall kvadrater telt)
Frø 2 x 10 6 celler/fat i6 cm fat med 5 ml vedlikeholdsmedier for transfeksjon og dyrkning av cellene i en fuktet 5% CO2 inkubator ved 37 °C. - Bytt ut vedlikeholdsmediet med 5 ml transfeksjonsmedier når cellene blir 50%-60% konfluente etter 18 timers kultur.
- Hold transfeksjonsreagenset ved romtemperatur i minst 30 minutter før transfeksjon.
- Tilsett 5,5 μg MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3-plasmid22 til 0,5 ml vanlig DMEM-medium i et sterilt 1,5 ml rør. Bland det forsiktig ved å banke på røret og la det sitte i 10 min.
- Tilsett 14,6 μL (3x plasmidmengden; v / w) transfeksjonsreagens til røret og bank forsiktig på røret hver 10. minutt tre ganger.
- Tilsett blandingen dråpevis til alle områder av oppvasken med pECO-cellene i transfeksjonsmedier. Flytt forsiktig oppvasken fremover og bakover 10 ganger og sidelengs 10 ganger. Inkuber oppvasken i en fuktet 5 % CO2 -inkubator ved 37 °C i 48 timer.
- Mål transfeksjonseffektiviteten ved florescensmikroskopi og flowcytometri for grønt fluorescerende protein (GFP) som beskrevet i22. Cellene styres først på FSC-A/FSC-H og FSC-A og SSC-A for å skaffe singleter. GFP + -populasjonen er styrt på FL1-plottet ved å sammenligne den med ikke-transfekterte celler.
- Samle og filtrer supernatantene gjennom et 0,45 μm sprøytefilter i et sterilt 50 ml rør. Bruk supernatantene umiddelbart til transduksjon eller knepp, frys dem i flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 °C inntil videre bruk.
MERK: pECO-celler må blandes riktig og sås jevnt i retter. La cellene spre seg ved å flytte oppvasken fremover og bakover 10 ganger og sidelengs 10 ganger mens du så. Celletallet som skal seedes, kan variere avhengig av variasjonene i tellingen. For å finne det optimale såcelletallet som kan oppnå 50% -60% sammenløp etter 18 timers kultur, er såceller med serielle fortynninger nyttig.
4. Lentiviral transduksjon
- Avlive 8-10 uker gamle CD45.1 kvinnelige C57BL6/J-mus (to til tre donormus per mottakermus) i et CO2 -kammer.
- Steriliser hele kroppen av musene med 70% etanol. Plasser musene på en steril kirurgisk pute på et Styrofoam-brett og fest bena gjennom musepoteputene.
- Klipp huden over bukhulen på midtlinjen og utvid det subkutane rommet mot bakbenene med skarp ende steril saks.
- Forleng snittet fra abdominal midtlinje ned til anklene. Utvid det subkutane rommet under bakbenene med bladene på skarp ende steril saks.
- Klipp akillessenen med en steril saks i skarpe enden. Hold senen med tang med tenner og kutt den andre enden festet til lårbenet for å fjerne gastrocnemius-muskelen.
- Klipp quadriceps-senen festet til kneet med skarp ende steril saks. Hold senen med tang med tenner og kutt muskelhodene festet til lårbenet for å fjerne gastrocnemius-muskelen.
- Klipp de andre musklene rundt lårbenet på enden festet til tibia med skarp ende steril saks.
- Klipp ankelen med skarp ende steril saks, slik at tibia forblir intakt. Hold den distale enden av lårbenet ved hjelp av tang med tenner og kutt hofteleddet med skarp ende steril saks, slik at lårhodet forblir intakt.
- Overfør tibias og lårben til strømningsbuffer i et sterilt 15 ml rør.
- Separat tibia og lårben ved å bryte kneet for hånd. Fjern patella, brusk og femorale kondyler for å avsløre tibialplatået og distale lårben for hånd. Fjern musklene ved hjelp av en steril gasbind og suge deretter beinene i strømningsbuffer.
- Skjær lårhalsen og skyll benmargscellene med strømningsbuffer fra begge ender av lårbenet ved hjelp av en 10 ml sprøyte med en 23 G nål.
- Skjær tibial malleolus og skyll benmargscellene med strømningsbuffer fra begge ender av tibia ved hjelp av en 10 ml sprøyte med en 23 G nål.
- Spre cellene ved å pipettere opp og ned med en 10 ml sprøyte med en 18 G kanyle. Sentrifuger encellesuspensjonen ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 5 ml RBC-lysisbuffer for å lyse RBC i 3 minutter.
- Tilsett 5 ml strømningsbuffer for å stoppe lysisen og sentrifuger cellesuspensjonen ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter.
- Plasser en 70 μm cellesil på et sterilt 50 ml rør. Suspender pelleten med 5 ml strømningsbuffer, bland og pass gjennom cellesilen for å samle cellene.
- Juster cellekonsentrasjonen med strømningsbuffer til 1 x 108/ml i polypropylenrør med rund bunn.
- Velg Lin-celler ved hjelp av et musehematopoietisk celleisolasjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Hold til side tre rør med 1 x 104 celler i 100 μL buffer for en ufarget kontroll og to enkle antistofffargede kontroller for APC-konjugert antimus CD117 (c-Kit) og PE-Cy7-konjugert antimus Ly-6A / E (Sca-1). Bruk 1 μL antistoff (fra 0,2 mg/ml lager) for hver av de enkelte antistofffargede kontrollene.
- Farg resten av cellene i et rør med begge antistoffene (4 μL av hver fra 0,2 mg/ml stamceller) i 400 μL. Inkuber rørene på is i mørket i 0,5-1 time.
- Etter farging vasker du cellene ved å tilsette 1 ml strømningsbuffer og sentrifuge ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter.
- Resuspender cellene for ufarget kontroll og de enkle antistofffargede kontrollene i 100 μL strømningsbuffer. Resuspender doble antistofffargede celler i 1 ml strømningsbuffer for sortering.
- Sorter hematopoietiske stamceller (HSC) som en LSK-populasjon ved hjelp av en cellesortering som beskrevet i23,24.
- Under farging, belegg en steril 6 cm tallerken med retronectin som følger: Forbered 100 μg / ml lager av retronectin i PBS og tilsett 0,9 ml PBS og 0,1 ml retronectin til en 6 cm tallerken. Belegg fatet i en steril hette ved romtemperatur i 2 timer. Fjern deretter retronectin og blokker parabolen med 0,5 ml filtrert 2% BSA (i PBS) i 30 minutter. Vask fatet med 5 ml PBS to ganger og parabolen er klar til transduksjon.
- Sentrifuger de sorterte HSC-ene eller usorterte Lin-celler ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter og resuspenderes i 3 ml 2x (cytokiner) IMDM-medier og 3 ml viral supernatant (generert fra trinn 3.10) i en retronektinbelagt tallerken. Inkuber fatet i en fuktet 5% CO2 -inkubator ved 37 ° C i 6 eller 24 timer.
MERK: I denne studien ble Lin-celler enten sortert eller usortert avhengig av eksperimentell design.
5. Serietransplantasjon (figur 1)
MERK: Primære mottakermus var 8-10 uker gamle mannlige C57BL6 / J-mus (CD45.2). De ble gitt vann ad libitum inneholdende antibiotika for å forhindre opportunistiske fordøyelsesinfeksjoner, fra 3 dager før transplantasjon til 7 dager etter transplantasjon. Primærmottakermus ble sublethalt bestrålt (4,75 Gy) 3 timer før transplantasjon25. Isofluran ble ikke påført mus ved intraperitoneal injeksjon.
- Etter transduksjon i 6 eller 24 timer, høst cellene ved sentrifugering ved romtemperatur og 400 x g i 3 minutter. Bruk trypsin til å samle cellene festet til parabolbunnen om nødvendig. Kast supernatanten og resuspender cellene i forvarmet PBS. Bestem volumet av PBS avhengig av antall mottakere (dvs. 0,1 ml/mus og 0,5 ml/mus for mottakere med henholdsvis retroorbitale og intraperitoneale injeksjoner).
- Plasser de subletalt bestrålte mottakermusene i et isofluran kammer (strømningshastigheten for oksygen er satt til 1,0 l/min og isofluran fordamper er satt til 5 %). Påfør våt salve i øynene for å forhindre tørrhet under anestesi. Musene er klare for ytterligere prosedyrer når hjerteslaget faller til 60 slag per min.
- Injiser celler i primære mottakermus retroorbitalt (0,1 ml/mus)7 eller intraperitonealt (0,5 ml/mus)26 med en 27 G1/2 nål. Observer musene kontinuerlig til de får tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Overvåk musene daglig for deres velvære etter transplantasjon.
- Etter 1 måned, samle blod ukentlig ved retro-orbital blødning for å overvåke leukocytose ved å evaluere fullstendig blodtelling (CBC) på en hemavet som beskrevet nedenfor.
- Plasser musen lateralt etter anestesi med isofluran (strømningshastigheten for oksygen er satt til 1,0 l/min og isofluransfordamperen er satt til 5 %). Musene er klare for ytterligere prosedyrer når hjerteslaget faller til 60 slag per min.
- Proptose øyet med tommelen og pekefingeren. Penetrer venøs sinus plexus med asteril hemacrit kapillærrør gjennom den indre canthus.
- Samle 20-25 μl blod inn i et EDTA-blodoppsamlingsrør og lukk øyelokkene for å stoppe blødningen. Påfør en dråpe gentamicinsulfat oftalmisk løsning på øyet.
- Ved endepunktet, når de hvite blodcellene (WBC) når 4 x 10 4 celler/μL, avliver du musen i et CO2 -kammer og isolerer benmargscellene ved å skylle lårbenene og tibias med strømningsbuffer, etterfulgt av RBC-lyse som nevnt i trinn4.
- På sluttpunktet, høst milnocyttene som nevnt nedenfor.
- Avlive musen i et CO2 -kammer. Plasser musene på en steril kirurgisk pute på et Styrofoam-brett og fest bena gjennom musepoteputene. Steriliser hele kroppen av musene med 70% etanol.
- Klipp huden og muskelen på midtlinjen for å eksponere bukhulen med skarp ende steril saks. Isoler milten med skarp ende steril saks og legg den i strømningsbuffer i et sterilt 15 ml rør.
- Mesh milten gjennom en 70 μm steril sil i en 6 cm tallerken med 3 ml strømningsbuffer. Overfør cellene fra parabolen til et sterilt 15 ml rør og sentrifuger encellesuspensjonen ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 5 ml RBC-lysisbuffer for å lyse RBC i 3 minutter. Tilsett 5 ml strømningsbuffer for å stoppe lysisen og sentrifuger cellesuspensjonen ved 4 °C og 400 x g i 3 minutter.
- Plasser en 70 μm cellesil på et sterilt 50 ml rør. Suspender pelleten med 5 ml strømningsbuffer, bland og pass gjennom cellesilen for å samle celler.
- Identifiser primære (1 °) AML-celler ved å farge splenocytter og benmargceller med FITC-konjugert anti-mus CD45.1 antistoff og detektere på et flowcytometer. Cellene styres først på FSC-A/FSC-H og FSC-A og SSC-A for å skaffe singleter. CD45.1+-populasjonen er inngjerdet på FL1-plottet ved å sammenligne den med ufargede celler.
- For sekundær (2°) transplantasjon, resuspender CD45.1 AML miltceller fra 1° r.o. mottakere i PBS (0.1 ml / mus) og injiser dem retro-orbitalt i CD45.2 mannlige C57BL6 / J mus. Parallelt, resuspender AML miltceller fra 1 ° i.p. mottakere i PBS (0.5 ml / mus) og injiser dem intraperitonealt i 8-12 uker gammelt rødt fluorescensprotein (RFP) -uttrykkende Ai14TdTomato hannmus27.
- For tertiær (3°) transplantasjon, resuspender AML-celler isolert fra benmargen eller bukhulen hos 2° i.p. mottakere og injiser dem intraperitonealt i henholdsvis Ai14TdTomato (RFP +) eller CD45.2 mus. Resuspender AML-celler isolert fra bukhulen til 2 ° r.o. mottakere og transplanter dem ved r.o. injeksjon i Ai14TdTomato (RFP +) mus.
MERK: For 2° transplantasjon identifiserte vi sykdomsprogresjonen hos 2° mottakere ved å overvåke CBC i perifert blod. For ytterligere å bekrefte etableringen av AML, samlet vi hele perifert blod ved hjertepunksjon samt benmarg, milt og lever. Videre utførte vi i.p. lavage for å samle i.p. celler. Enkeltcellesuspensjoner ble ervervet fra benmarg, milt og i.p. skylling som beskrevet ovenfor. Celler fra disse stedene ble analysert på et flowcytometer etter RBC-lysis. AML-celler ble gjenkjent som RFP-negative (RFP-) celler. For 3° transplantasjon tok vi prøver av blod, benmarg, milt, lever og i.p. celler på endepunktet; RFP- eller CD45.1+-celler ble identifisert som AML-celler og undersøkt med flowcytometri. Det ble ikke gitt bestråling eller antibiotikavann til 2° og 3° resipientmus.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av MLL-AF9 viral transduksjon i benmargs-HSC og serietransplantasjon (1°, 2° og 3°). Sortering av Sca-1 og c-Kit dobbel positiv populasjon ved hjelp av en cellesortering vist i den stiplede skyggeboksen anses som valgfritt, hvis ressursene tillater det. Figuren ble laget ved hjelp av BioRender (https://biorender.com/). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Intraperitoneal skylling
- Injiser 5 ml ufullstendige IMDM-medier i bukhulen to ganger for å samle cellene i en 15 ml steril slange. Sentrifuger celleopphenget ved romtemperatur og 400 x g i 3 minutter. Transplanter AML-celler (4 x 105 celler/mus) fra bukhulen hos 2° mottakere via i.p. injeksjon i 3° CD45.2 mottakermus (n = 3).
7. Histologisk analyse 28
- Isoler milt, lever og lårben fra mus ved eutanasi. Fest dem i 5 ml 10 % (v/v) bufret formalin. Prøv milt og lever fra friske kolleger for sammenligninger.
- Legg faste vev i parafin og kutt dem i seksjoner. Flekk seksjonene med hematoksylin og eosin (H &E) fargestoffer.
- Få bildene under et mikroskop ved 20x forstørrelse installert med en kompatibel programvare for histologisk analyse.
8. Utføre semi-kvantitativ PCR (qPCR)
- Forbered RNA i RNA-reagens i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk 0,5-1,0 μg RNA til å syntetisere cDNA ved hjelp av et cDNA revers transkripsjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk cDNA til å utføre qPCR ved hjelp av et qPCR-sett og kjør prøvene i et qPCR-system. Bruk følgende forhåndsvaliderte TaqMan-prober: KMT2A (MLL; Ref Seq: NM_001197104(2), IDT)29 og 18S ribosomalt RNA (Hs99999901_s1).
- Legg KMT2A - og 18S-forsterkerne på en 2% agarosegel for å visualisere uttrykket. Skaff bilder i et bildeapparat installert med det kompatible programmet.
9. Databehandling
- Analyser resultatene ved hjelp av statistisk analyseprogramvare og presenter resultatene som gjennomsnittlig ± SEM. Generer figurer ved hjelp av et kommersielt illustratorverktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenligning av transplantasjonseffektiviteten til murine AML-celler ved bruk av r.o. og i.p. transplantasjonsveier
Tidligere ble etablering av 1° AML rapportert hos mottakermus retroorbitalt transplantert med MLL-AF9-transduserte LSK-celler, og transplanterbarheten av 1° AML-celler ble demonstrert ved serietransplantasjon30. Denne studien er den første som evaluerer muligheten for å bruke benmarg Lin-celler til å utføre transplantasjon. Funn av avvikende leukocytose (figur 2A) og økt infiltrasjon av leukemiske celler (CD45.1+) i benmarg og milt (figur 2B) støtter muligheten for å bruke benmargs Lin-celler til å generere 1° AML. For å sammenligne sykdomsinduksjonsperioden ble to donormus per mottaker avlivet for å isolere enten LSK- eller Lin-celler. Fra resultatene ble det ikke observert signifikante forskjeller hos 1° mottakere transplantert med LSK- eller Lin-celler (figur 2C).
Ved undersøkelse av metastase ved 1° AML ble det oppdaget at AML-cellene spredte seg i bukhulen hos 1° mottakere av MLL-AF9-transducerte Lin-celler (tilleggsfigur 1). Dette funnet inspirerte letingen for å teste om i.p. injeksjon kunne vedtas i genereringen av murine AML, som kan tjene som en ny og enklere transplantasjonsvei. På grunn av suksessen med å bruke benmargens Lin-populasjon som AML-donorceller, bekreftet nåværende data etableringen av 1° AML via i.p. injeksjon av MLL-AF9-transducerte benmargs-Lin-celler, som sett i form av leukocytose (figur 2D) og tilstedeværelse av AML-celler (CD45.1+) i benmarg og milt hos mottakermus (figur 2E). Transplantasjon via intravenøs injeksjon tok imidlertid lengre tid å utvikle AML enn via r.o.-injeksjon, til tross for at mottakerne fikk like mange donorceller (figur 2F). Dessuten syntes mus transplantert retro-orbitalt med flere Lin-celler (5,125 x 10 6 celler / mus) i figur 2F å utvikle AML raskere enn de transplanterte med færre Lin-celler (3,69 x 10 6 celler / mus) i figur 2C.
På grunn av inkonsistens i inkubasjonstiden hos 1° AML-mottakere (figur 2F) ble det forsøkt å teste i.p.-transplantasjonen hos 2° mottakere. Ved 2° transplantasjon ble det utført intraperitonealt injeksjon med 8 x 105 AML-celler isolert fra intraperitonealt transplanterte 1° mottakere. De 2° mottakerne viste leukocytose (figur 2G) og signifikant hepatosplenomegali (figur 2H) mindre enn 1 måned etter transplantasjonen, en klar fremgang fra 1° transplantasjon. I samsvar med denne observasjonen ble det også påvist AML-celler (RFP-) i perifert blod, benmarg og milt (figur 2I) samt i bukhulen (tilleggsfigur 1). Dessuten bekreftet uttrykket av onkogen KMT2A i blod, milt og lever hos 2° mottakere også den vellykkede generasjonen av AML (figur 2J). Videre viste histologisk analyse videre infiltrasjon av leukemiske celler i milt og lever hos intraperitonealt transplanterte mus (figur 2K). Disse dataene bekrefter at i.p. injeksjonsgenererte 1° AML-celler kan transplanteres hos 2° mottakere. Videre oppnådde i.p.-injeksjon av 8 x 10 5 AML-celler per mus i mottakere sammenlignbar transplantasjon med r.o.-injeksjon av 8 x 105 AML-celler per mus i mottakere (figur 2L).
En av nøkkelfunksjonene til LSC er seriell transplanterbarhet; For ytterligere å fastslå etableringen av AML hos 2° mottakere, forsøkte denne protokollen å verifisere om AML-celler fra 2° IP-transplantasjon forble serielt transplanterbare, samt muligheten for stamcelletransplantasjon ved IP-injeksjon i 3° transplantasjon. AML-celler isolert fra enten benmarg (8 x 10 5 leukemiske celler/mus i 0,5 ml PBS) eller intravenøs skylling (4 x 10 5 leukemiske celler/mus i0,5 ml PBS) hos 2° mottakere ble injisert i 3° mottakere. Selv om de ble transplantert med donorceller generert fra forskjellige kilder, viste 3° mottakermus akutt AML-tegn (innen 3 og 4 uker for henholdsvis benmargceller og i.p.-celler), inkludert leukocytose (figur 3A) og hepatosplenomegali (figur 3B), tilstedeværelse av leukemiske celler i blod, benmarg og milt (figur 3C) og ekspresjon av KMT2A (figur 3D ). Histologisk observasjon av femur og milt viste videre infiltrasjon av leukemiske celler (figur 3E). Til sammenligning var r.o.-injeksjon av leukemiske splenocytter (4 x 105 celler) fra 2°-mottakere også like i stand til å transplantere og utvikle AML hos 3°-mottakere, karakterisert ved leukocytose (tilleggsfigur 2A), hepatosplenomegali (tilleggsfigur 2B) og infiltrasjon av AML-celler i blod, benmarg og milt (tilleggsfigur 2C).
Intraperitoneal transplantasjon er effektivt selv ved 3° transplantasjon av AML-celler
Sammenliknet med 2°- og 3°-transplantasjonene kunne man lett konkludere med at 3°-transplantasjonen (figur 3F) gikk mye raskere enn 2°-transplantasjonen (figur 2L) for både i.p.- og r.o.-injeksjoner. Spesielt utviklet i.p. injeksjon av 4 x 105 AML-celler/mus AML senere enn r.o. injeksjon av samme antall AML-celler i 6 dager (figur 3F), noe som muligens indikerer tiden brukt på migrasjon fra bukhulen til benmargsnisjen. Interessant, den høye frekvensen av leukemiske celler i bukhulen (tilleggsfigur S2) i 3 ° transplanterte mus antydet at bukhulen også kan gi nisje for rask ekspansjon av leukemiske celler. Dessuten indikerte tilstedeværelsen av leukemiske celler i bukhulen på 1° og 3° mottakere transplantert retro-orbitalt den gjensidige sirkulasjonen av leukemiske celler mellom bukhulen og blodsystemet, noe som rettferdiggjorde i.p. transplantasjon. Samlet validerer disse funnene bruken av i.p. injeksjon i serietransplantasjon av AML.
Figur 2: Generering av murine AML-modell ved 1°- og 2°-transplantasjon. (A) Fullstendig blodtelling (CBC; 1 x 10 3 celler/μL blod), WBC, nøytrofil (NE), lymfocytt (LY), monocytt (MO), eosinofil (EO) og basofil (BA) profil av 1° mottakermus transplantert retroorbitalt med MLL-AF9-transduserte benmargs-Lin-celler (5,125 x 106 celler/mus) av hemavet (n =3). (B) Flowcytometrisk analyse av frekvensen av AML-celler (CD45.1+) i benmarg og milt hos 1° CD45.2 mottakermus transplantert retroorbitalt med MLL-AF9-transducerte benmargs-Lin- (5,125 x 106 celler/mus) celler (n = 3). (C) Inkubasjonsvarighet på 1° AML hos mottakere transplantert retroorbitalt med MLL-AF9-transducerte benmargs LSK-celler (3,16 x 105 celler/mus isolert fra to givere, n = 4) eller Lin-celler (3,69 x 106 celler/mus isolert fra to givere, n = 3). Hver mottaker fikk celler isolert fra to donorer. (D) CBC-analyse av 1° mottakermus transplantert intraperitonealt med MLL-AF9-transducerte benmargs-Lin-celler (5,125 x 106 celler/mus) av hemavet (n = 4). (E) Flowcytometrisk analyse av frekvensen av AML-celler (CD45.1+) i benmarg og milt hos 1° CD45.2 mottakermus transplantert intraperitonealt med MLL-AF9-transducerte benmargs-Lin-celler (5,125 x 10 6 celler/mus, n = 3). (F) Inkubasjonsvarighet på 1° AML hos mottakere transplantert retroorbitalt (n = 3) eller intraperitonealt (n = 3) med MLL-AF9-transducerte benmargs-Lin-celler. Hver mottaker fikk samme mengde donorceller (5,125 x 106 celler/mus). (G) CBC-analyse av 2° mottakere transplantert intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isolert fra milten hos 1° i.p. transplanterte mottakere av hemavet (n = 3). (H) Vekt (mg) av milt og lever hos 2° mottakermus transplantert intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isolert fra milten hos 1° i.p. transplanterte mottakere. De skyggelagte områdene representerer de normale vektområdene for milt og lever. Representativt bilde av milt og lever fra 2° mottakermus og friske kolleger. (I) Flowcytometrisk analyse av frekvensen av AML-celler (RFP-) i blod, benmarg og milt hos 2° RFP+ mottakermus transplantert intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isolert fra milten hos 1° i.p.-transplanterte mottakere (n = 3). (J) Genuttrykk for KMT2A og 18S presentert som et DNA-bånd. RNA ble isolert fra blod, benmarg, milt og lever hos 2° mottakermus transplantert intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler / mus) isolert fra milten hos 1 ° i.p. transplanterte mottakere. (K) Representative bilder av histologiske forandringer i milten (venstre panel) og lever (høyre panel) hos 2° mottakere transplantert intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isolert fra milten hos 1° i.p. transplanterte mottakere og friske kolleger. (L) Inkubasjonsvarighet på 2° AML hos mottakere transplantert retroorbitalt (4 x 10 5/mus, n = 9) eller intraperitonealt (8 x 105/mus, n = 4) med AML-celler isolert fra henholdsvis 1° r.o. og i.p. transplanterte mottakere. Resultatene er gjennomsnittlige ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: 3° transplantasjon av AML-celler via intravenøs transplantasjon. (A-E) 3° RFP+ eller CD45.2 mottakermus. Venstre: i.p. injeksjon av AML-celler (8 x 105 celler/mus) fra benmargen hos 2° mottakere. Høyre: i.p. injeksjon av AML-celler (4 x 105 celler/mus) fra bukhulen (i.p.) hos 2° mottakere (n = 3). (A) CBC-analyse av 3° mottakermus med hemavet. (B) Vekt (mg) av milt og lever hos 3° mottakermus. De skyggelagte områdene representerer de normale vektområdene for milten og leveren. (C) Flowcytometrisk analyse av frekvensen av AML-celler (venstre: RFP-; høyre: CD45.1+) i blod, benmarg og milt hos 3° mottakermus. (D) Genuttrykk av KMT2A og 18S presentert som et DNA-bånd. RNA ble isolert fra blod, benmarg, milt og lever hos 3° mottakermus. (E) Representative bilder av histologiske forandringer i milten (venstre panel) og lårben (høyre panel) hos 3° mottakermus. (F) Inkubasjonsvarighet på 3° AML hos mottakere transplantert retroorbitalt (4 x 10 5 celler/mus, n = 3) eller intraperitonealt (4 x 105 celler/mus, n = 3) med AML-celler isolert fra henholdsvis 2° r.o. og i.p. transplanterte mottakere. Resultatene er gjennomsnittlige ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Væskestrømscytometrisk analyse av AML-celleinfiltrasjon i bukhulen. Frekvens av AML-celler i peritoneal skylling hos 1° mottakere transplantert retroorbitalt (1° RO, n = 2), 2° mottakere transplantert intraperitonealt (2° IP, n = 2) og 3° mottakere transplantert via i.p. injeksjon med benmargs AML-celler (3° BM-IP, n = 3) og i.p. AML-celler (3° IP-IP, n = 3), samt 3° mottakere transplantert via r.o. injeksjon av AML-splenocytter (3° SP-RO, n = 3). Resultatene er gjennomsnittlige ± SEM. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: 3° transplantasjon av AML-miltocytter via r.o. injeksjon. (A) CBC-analyse av 3° mottakermus retro-orbitalt transplantert med AML-celler (4 x 105 celler/mus) fra milten til 2° mottakermus. (B) Vekt (mg) av milt og lever av 3° retro-orbitalt transplanterte mottakermus. De skyggelagte områdene representerer de normale vektområdene for milten og leveren. (C) Frekvens av AML-celler (RFP-) i blod, benmarg og milt hos 3° retroorbitalt transplanterte mottakermus (n = 3). Resultatene er gjennomsnittlige ± SEM. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Disse ovenfor beskrevne studiene gir støttende bevis på at transplantasjon av Lin-celler er sammenlignbar med LSK-celler i genereringen av 1° murine AML. I tillegg viser de nåværende dataene også at i.p. injeksjon er en effektiv og praktisk metode for å etablere murine AML sammenlignet med intravenøs (eller r.o.) injeksjon.
I tillegg til LSK-celler har andre populasjoner som granulocytt-monocytt-stamfar (GMP), vanlig lymfoid stamfar (CLP) og vanlig myeloid stamfar (CMP) blitt rapportert å være substituert som donorceller i genereringen av 1° MLL-AF9-indusert AML med forskjellige inkubasjonsvarigheter31,32, selv om kvantitativ sammenligning mangler for å foreslå det optimale valget. I den nåværende studien hadde Lin- og LSK isolert fra de samme donormusene ingen tilsynelatende forskjell i genereringen av 1° MLL-AF9-indusert AML, gitt at transducerte myeloide stamceller (Sca-1-) var i stand til å initiere AML33. Tatt i betraktning kostnadene og tiden som kreves for flowcytometribasert sortering av LSK-populasjonen, støtter disse studiene bruken av Lin-populasjonen som donorceller for 1° transplantasjon. Dermed er trinnene fra 4.19 til 4.23 i denne protokollen ikke nødvendige, men valgfrie, og påvirker ikke sluttresultatet.
Når det gjelder mengden donormus i 1° transplantasjon, var en donor i stand til å gi ~ 1,0 til 1,5 x 105 LSK-celler, og en mottaker transplantert med denne mengden LSK-celler utviklet 1 ° AML på ca. 4 måneder. Men å øke antall givere for å bygge opp LSK-celler opp til ~ 3 x 105 celler per mottaker kan forkorte inkubasjonsvarigheten til ~ 70 dager. Dermed bør to donorer være nok til raskt å generere 1 ° AML. Dette prinsippet gjelder også for Lin-celler, hvor ~1,0 til 2,5 x 106 Lin-celler kan isoleres fra hver donormus. Men når donorcelletettheten ble økt, var behandlingstiden for leukemogenese betydelig kortere. Disse dataene bør tas i betraktning ved fastsettelse av antall donormus i trinn 4.1.
Sammenlignet med r.o. injeksjon, tok i.p. injeksjon ca ~ 20 dager til å utvikle fullblåst 1 ° AML, men denne begrensningen ble overvunnet ved å øke donorcellene for i.p. injeksjon. Til tross for en slik tilsynelatende forskjell viste begge metodene lignende transplantasjonsrate (>80 %) i benmarg og milt ved endepunktet, noe som indikerer den generelle anvendeligheten av intravenøs injeksjon ved 1°-transplantasjon ved AML. Den relativt lange inkubasjonstiden for 1° transplantasjon, samt dens uforutsigbare sykdomsprogresjon når det gjelder inkonsistens i latens hos mottakermus, er en viktig begrensning for kontrollerte eksperimenter, som farmakologiske intervensjoner og mekanistiske studier. Det anbefales derfor å transplantere 1° leukemiske celler ved senere serietransplantasjoner, typisk 2°-transplantasjon (figur 1). Siden opptil 3 x 108 leukemiske celler i milten (og 6 x 107 celler i benmarg) kan genereres fra hver enkelt 1 ° mottaker ved endepunktet, noe som ville være tilstrekkelig til å gjennomføre 2 ° transplantasjon på mer enn 300 mus, foreslås det å transplantere så mange celler som mulig til færre mottakere for å forkorte latensen og øke transplantasjonshastigheten på 1 ° transplantasjon, som er viktig for trinn 4.1 og trinn 5.2.
Gitt sin konsistente og korte latens, kan 2 ° transplantasjon benyttes i flere applikasjoner, inkludert in vivo eksperimenter nevnt ovenfor. Videre forenkler i.p. injeksjon også prosedyren for rikelig transplantasjon for uerfarne teknikere. Sammenlignet med r.o. injeksjonsruten, som vanligvis genererer AML i 3 uker, tok i.p. injeksjonsmetoden litt lengre tid (~ 4 uker) med samme antall donorceller for å etablere en fullblåst AML. Selv om det er relativt enklere og mer praktisk, kan økning av transplantert celletall eller utføring av tertiær transplantasjon også akselerere utviklingen av AML ved i.p. injeksjon.
Oppsummert er den største begrensningen ved denne teknikken lengre inkubasjonstid enn intravenøs injeksjon med samme mengde donorceller i både 1° og 2° transplantasjoner. Det kan imidlertid lett overvinnes ved å øke cellenummeret som skal transplanteres. Bortsett fra de åpenbare fordelene, har denne teknikken også noen andre applikasjoner. For eksempel kan evnen til å bruke i.p. transplantasjonsmetoder også tjene til rutinemessig dyrkning av disse cellene uten behov for dyre in vitro kulturmedier. For å utvide anvendelsen av denne teknikken i andre hematologiske maligniteter, som lymfoid leukemi og kronisk myelogen leukemi, og pasientavledede xenotransplantater, må videre studier gjøres i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Huck Institute's Flow Cytometry Core Facility og Histopathology Core Facility of the Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, for å gi rettidig teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA prosjekt 4771, tiltredelsesnummer 00000005 til KSP og RFP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
References
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
