استكشاف العمل الدوائي والآلية الجزيئية للساليدروسيد في تثبيط تكاثر خلايا MCF-7 وهجرتها
Summary
يصف هذا البروتوكول استراتيجية شاملة لتقييم العمل الدوائي وآلية الساليدروسيد في تثبيط تكاثر خلايا MCF-7 وهجرتها.
Abstract
يحتوي Salidroside (Sal) على أنشطة دوائية مضادة للسرطان ومضادة لنقص الأكسجين ومضادة للالتهابات. ومع ذلك ، فقد تم توضيح آلياته الأساسية المضادة لسرطان الثدي بشكل غير كامل. ومن ثم ، يهدف هذا البروتوكول إلى فك تشفير إمكانات Sal في تنظيم مسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 في الانتشار الخبيث لخلايا سرطان الثدي البشري MCF-7. أولا ، تم تقييم النشاط الدوائي ل Sal ضد MCF-7 بواسطة CCK-8 ومقايسات خدش الخلية. علاوة على ذلك ، تم قياس مقاومة خلايا MCF-7 عن طريق مقايسات الهجرة وغزو Matrigel. بالنسبة لموت الخلايا المبرمج ومقايسات الدورة ، تمت معالجة خلايا MCF-7 في خطوات مع الملحق V-FITC / PI ومجموعات الكشف عن تلطيخ دورة الخلية لتحليلات قياس التدفق الخلوي ، على التوالي. تم فحص مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) و Ca2+ بواسطة DCFH-DA و Fluo-4 AM تلطيخ المناعي. تم تحديد أنشطة Na + -K + -ATPase و Ca2 + -ATPase باستخدام المجموعات التجارية المقابلة. تم تحديد مستويات البروتين والتعبير الجيني في موت الخلايا المبرمج ومسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 باستخدام تحليلات اللطخة الغربية و qRT-PCR ، على التوالي. وجدنا أن علاج سال حد بشكل كبير من انتشار وهجرة وغزو خلايا MCF-7 ذات التأثيرات المعتمدة على الجرعة. وفي الوقت نفسه ، أجبرت إدارة سال أيضا خلايا MCF-7 بشكل كبير على الخضوع لموت الخلايا المبرمج وإيقاف دورة الخلية. أظهرت اختبارات التألق المناعي أن سال حفز بشكل ملحوظ إنتاج ROS و Ca2+ في خلايا MCF-7. أكدت بيانات أخرى أن سال عزز مستويات التعبير عن البروتينات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج ، باكس ، بيم ، كاسباز المشقوق -9/7/3 ، والجينات المقابلة لها. باستمرار ، قلل تدخل سال بشكل بارز من التعبير عن بروتينات Bcl-2 و p-PI3K / PI3K و p-AKT / AKT و mTOR و HIF-1α و FoxO1 والجينات المقابلة لها. في الختام ، يمكن استخدام Sal كمركب مشتق من الأعشاب لعلاج سرطان الثدي ، لأنه قد يقلل من الانتشار الخبيث والهجرة وغزو خلايا MCF-7 عن طريق تثبيط مسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
Introduction
كواحد من أكثر أنواع السرطان التي يتم تشخيصها شيوعا والأورام الخبيثة الأكثر شيوعا ، تشير أحدث الإحصاءات إلى ظهور 2.3 مليون حالة من سرطان الثدي حول العالم بحلول عام 2020 ، وهو ما يمثل 11.7٪ من جميع حالات السرطان1. تشمل الأعراض الشائعة لسرطان الثدي إيلام الثدي وخزه ، وكتل الثدي والألم ، وإفرازات الحلمة ، وتآكل الجلد أو غائرته ، وتضخم الغدد الليمفاوية الإبطية 1,2. والأمر الأكثر إثارة للقلق هو أن عدد الحالات الجديدة ومعدل الإصابة الإجمالي بسرطان الثدي مستمران في الزيادة بمعدل هائل كل عام ، وهو ما يمثل 6.9٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان1. في الوقت الحاضر ، لا يزال التدخل في سرطان الثدي ينطوي بشكل أساسي على العلاج الكيميائي والجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الشامل. على الرغم من أن العلاج يمكن أن يقلل بشكل فعال من معدل التكرار ومعدل وفيات المرضى ، إلا أن تطبيق العلاج على المدى الطويل غالبا ما يسبب مقاومة للأدوية المتعددة ، وتساقط الشعر في منطقة كبيرة ، والغثيان والقيء ، وعبء عقلي خطير 2,3. والجدير بالذكر أن الخطر المحتمل لنقائل الأعضاء المتعددة من سرطان الثدي يجبر الناس أيضا على البحث عن مصادر عشبية جديدة للعلاج الدوائي 4,5.
الإشارات بوساطة فوسفوينوسيتيد 3 كيناز (PI3K) متورطة في نمو سرطان الثدي وتكاثره وبقائه على قيد الحياة من خلال الربط الذي يؤثر على التعبير عن جينات متعددة6. كبروتين استشعار إشارة المصب من PI3K ، تشير العديد من الأدلة إلى أن بروتين كيناز B (AKT) يمكن أن يقترن بهدف الثدييات لبروتين rapamycin (mTOR) لزيادة سرطان الثدي7،8،9. علاوة على ذلك ، زعم أيضا أن إلغاء تنشيط إشارات PI3K / AKT / mTOR هو عنصر رئيسي في الأدوية التي تثبط الانتشار الخبيث وتحفز موت الخلايا المبرمج في سرطان الثدي10،11،12. من المعروف أن نقص الأكسجة الشديد في البيئة المكروية للورم يفرض زيادة هائلة في العامل 1 ألفا المحرض على نقص الأكسجة (HIF-1α) ، مما يزيد من تفاقم تطور سرطان الثدي13،14،15. في موازاة ذلك ، يؤدي تحفيز AKT أيضا إلى تراكم مفرط ل HIF-1α ، مما يحد من موت الخلايا المبرمج في عينات سرطان الثدي16,17. ومن المثير للاهتمام ، أن تنشيط إشارات PI3K-AKT-HIF-1α قد تم تأكيده للمشاركة في التقدم المرضي وورم خبيث في مجموعة متنوعة من السرطانات ، بما في ذلك سرطان الرئة18 وسرطان القولون والمستقيم19 وسرطان المبيض20 وسرطان البروستاتا21. بالإضافة إلى تنسيقه بواسطة HIF-1α ، يتم أيضا تشغيل التعبير المفرط لعامل نسخ الرأس المتشعب 1 (FoxO1) عن طريق تحفيز إشارات AKT ، مما يعزز توقف الدورة وتثبيط موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الثدي22,23. معا ، تشير الأدلة القوية المذكورة أعلاه إلى أن تثبيط سلسلة إشارات PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 قد يكون هدفا جديدا محتملا للعلاج الدوائي في سرطان الثدي.
ثبت على نطاق واسع أن Salidroside (Sal) يمارس أنشطة مضادة للسرطان24،25 ، ومضاد لنقص الأكسجة 26،27،28،29 ، والأنشطة الدوائية المعززة للمناعة30. إنه مسحوق بني فاتح أو بني قابل للذوبان في الماء بسهولة ، وهو نوع من جليكوسيد phenylethanoid ، وله صيغة بنية كيميائية من C14H 20 O7 ووزن جزيئي300.331,32. أظهرت التحقيقات الدوائية الحديثة أن Sal يمكن أن يعزز موت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان المعدة عن طريق تقييد إشارات PI3K-AKT-mTOR24. تشير أدلة أخرى أيضا إلى أن قمع إشارات PI3K-AKT-HIF-1α بواسطة علاج Sal قد يساهم في موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية من خلال تعزيز حساسيتها لعوامل العلاج الكيميائي25. تشير الدلائل أيضا إلى أن Sal يقيد هجرة الخلايا وغزوها ويسبب توقف الدورة من خلال تعزيز موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الثدي البشري MCF-733,34. ومع ذلك ، يبقى أن نرى ما إذا كان بإمكان Sal تنظيم إشارات PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 وتمنع الانتشار الخبيث لخلايا MCF-7. لذلك ، يهدف هذا البروتوكول إلى استكشاف تأثيرات Sal على هجرة خلايا MCF-7 ، والغزو ، ودورة الخلية ، وموت الخلايا المبرمج عبر مسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. يمكن أن توفر استراتيجيات البحث المتكاملة التي تضم تجارب تقليدية ومنخفضة التكلفة ومستقلة ، مثل تقييمات هجرة الخلايا والغزو ، وموت الخلايا المبرمج واكتشاف دورة الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وتحديد مضان الكالسيوم2+ ، وما إلى ذلك ، مرجعا للتصميم العام لتجارب أبحاث مكافحة السرطان مع الأدوية العشبية التقليدية. العملية التجريبية لهذه الدراسة موضحة في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصيب سرطان الثدي الأفراد من جميع الأعمار ويسبب عبئا جسديا وعقليا لا يحصى وضغطا اقتصاديا كبيرا1. كما اجتذب سرطان الثدي ، مع زيادة معدلات المراضة والوفيات كل عام ، اهتماما عالميا من حيث البحث عن علاجات مركبة عشبية فعالة تتجاوز العلاجات التقليدية 4,5</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل لجنة الصحة في مقاطعة سيتشوان (120025).
Materials
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
- Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
- Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
- Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
- Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. 암 연구학. 82 (12), 2269-2280 (2022).
- Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
- Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
- Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
- Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
- Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
- Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
- Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
- You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
- La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
- Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
- Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
- Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
- Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
- Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
- Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
- Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
- Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
- Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
- Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
- Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
- Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
- Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
- Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
- Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research – Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
- Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
- Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
- Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
- Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).
