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의학

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen

Published: June 09, 2023
doi:
10.3791/65634
, , , , , , ,
1Pathology Department,Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery,the Third People’s Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine umfassende Strategie zur Bewertung der pharmakologischen Wirkung und des Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen.

Abstract

Salidrosid (Sal) enthält antikarzinogene, antihypoxische und entzündungshemmende pharmakologische Aktivitäten. Die zugrundeliegenden Anti-Brustkrebs-Mechanismen sind jedoch nur unvollständig aufgeklärt. Daher sollte dieses Protokoll das Potenzial von Sal bei der Regulierung des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs bei der malignen Proliferation menschlicher Brustkrebs-MCF-7-Zellen entschlüsseln. Zunächst wurde die pharmakologische Aktivität von Sal gegen MCF-7 mittels CCK-8 und Zell-Scratch-Assays untersucht. Darüber hinaus wurde die Resistenz von MCF-7-Zellen durch Migrations- und Matrigel-Invasions-Assays gemessen. Für Zellapoptose und Zyklusassays wurden MCF-7-Zellen schrittweise mit Annexin V-FITC/PI bzw. Zellzyklus-Färbe-Detektionskits für Durchflusszytometrie-Analysen prozessiert. Die Gehalte an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Ca2+ wurden mittels DCFH-DA und Fluo-4 AM Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Die Aktivitäten von Na+-K+-ATPase undCa2+-ATPase wurden mit den entsprechenden kommerziellen Kits bestimmt. Die Protein- und Genexpressionsniveaus in der Apoptose und im PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg wurden mit Hilfe von Western-Blot- bzw. qRT-PCR-Analysen bestimmt. Wir fanden heraus, dass die Sal-Behandlung die Proliferation, Migration und Invasion von MCF-7-Zellen mit dosisabhängigen Effekten signifikant einschränkte. In der Zwischenzeit zwang die Sal-Verabreichung auch MCF-7-Zellen auf dramatische Weise dazu, Apoptose und Zellzyklus-Arrest zu durchlaufen. Die Immunfluoreszenztests zeigten, dass Sal die Produktion von ROS und Ca2+ in MCF-7-Zellen beobachtbar stimulierte. Weitere Daten bestätigten, dass Sal die Expressionsniveaus der pro-apoptotischen Proteine Bax, Bim, gespaltener Caspase-9/7/3 und der entsprechenden Gene förderte. Konsequenterweise reduzierte die Sal-Intervention die Expression der Proteine Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α und FoxO1 und ihrer entsprechenden Gene deutlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Sal als potenzielle pflanzliche Verbindung zur Behandlung von Brustkrebs verwendet werden kann, da es die maligne Proliferation, Migration und Invasion von MCF-7-Zellen reduzieren kann, indem es den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg hemmt.

Introduction

Als eine der am häufigsten diagnostizierten Krebsarten und häufigsten bösartigen Erkrankungen zeigen die neuesten Statistiken, dass bis 2020 weltweit 2,3 Millionen Fälle von Brustkrebs aufgetreten sind, was 11,7 % aller Krebsfälle ausmacht1. Häufige Symptome von Brustkrebs sind Brustspannen und -kribbeln, Knoten und Schmerzen in der Brust, Ausfluss aus der Brustwarze, Erosion oder eingesunkene Haut und vergrößerte axilläre Lymphknoten 1,2. Noch alarmierender ist, dass die Zahl der Neuerkrankungen und die Gesamtinzidenz von Brustkrebs jedes Jahr mit einer überwältigenden Rate zunehmen und 6,9 % der krebsbedingten Todesfälle ausmachen1. Derzeit umfasst die Brustkrebsintervention noch hauptsächlich Chemotherapie, Operation, Strahlentherapie und eine umfassende Behandlung. Obwohl die Behandlung die Rezidivrate und die Mortalitätsrate der Patienten wirksam senken kann, führt die langfristige Anwendung der Behandlung häufig zu Multiresistenzen, großflächigem Haarausfall, Übelkeit und Erbrechen sowie zu schweren psychischen und psychischen Belastungen 2,3. Insbesondere das potenzielle Risiko von multiplen Organmetastasen durch Brustkrebs zwingt die Menschen auch dazu, nach neuen pflanzlichen Quellen für die medikamentöse Therapie zu suchen 4,5.

Die Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-vermittelte Signalübertragung ist am Wachstum, der Proliferation und dem Überleben von Brustkrebs durch Spleißen beteiligt, das die Expression mehrerer Gene beeinflusst6. Als nachgeschaltetes signalsensitives Protein von PI3K deuten zahlreiche Hinweise darauf hin, dass die Proteinkinase B (AKT) mit dem Säugetier-Target of Rapamycin (mTOR)-Protein koppeln könnte, um Brustkrebs weiter zu erhöhen 7,8,9. Darüber hinaus wurde behauptet, dass die Deaktivierung des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs auch eine Schlüsselkomponente in Medikamenten ist, die die maligne Proliferation hemmen und die Apoptose bei Brustkrebs stimulieren10,11,12. Es ist bekannt, dass eine extreme Hypoxie in der Mikroumgebung des Tumors zu einem massiven Anstieg des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 alpha (HIF-1α) führt, der das Fortschreiten von Brustkrebs weiter verschlechtert13,14,15. Parallel dazu führt die AKT-Stimulation auch zu einer übermäßigen Akkumulation von HIF-1α, wodurch die Apoptose in Brustkrebsproben eingeschränktwird 16,17. Interessanterweise wurde bestätigt, dass die Aktivierung des PI3K-AKT-HIF-1α-Signalwegs an der pathologischen Progression und Metastasierung bei einer Vielzahl von Krebsarten beteiligt ist, darunter Lungenkrebs18, Darmkrebs19, Eierstockkrebs20 und Prostatakrebs21. Neben der Orchestrierung durch HIF-1α wird die Überexpression des Transkriptionsfaktors 1 (FoxO1) auch durch die Stimulation des AKT-Signals ausgelöst, die den Zyklusstillstand und die Hemmung der Apoptose in Brustkrebszellen fördert22,23. Zusammengenommen deuten die oben genannten soliden Beweise darauf hin, dass die Hemmung der Kaskade des PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalwegs ein potenzielles neues Ziel für die medikamentöse Therapie bei Brustkrebs sein könnte.

Es wurde allgemein nachgewiesen, dass Salidrosid (Sal) krebshemmende24,25, hypoxiehemmende 26,27,28,29 und immunstärkende pharmakologische Aktivitätenausübt 30. Es ist ein hellbraunes oder braunes Pulver, das leicht in Wasser löslich ist, eine Art Phenylethanoidglykosid ist und eine chemische Strukturformel vonC14H20O7und ein Molekulargewicht von300,331,32 aufweist. Moderne pharmakologische Untersuchungen haben gezeigt, dass Sal die Apoptose von Magenkrebszellen fördern kann, indem es den PI3K-AKT-mTOR-Signalweg hemmt24. Weitere Hinweise deuten auch darauf hin, dass die Unterdrückung des PI3K-AKT-HIF-1α-Signalwegs durch die Behandlung mit Sal zur Apoptose von Krebszellen beitragen kann, indem sie deren Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapeutika erhöht25. Es gibt auch Hinweise darauf, dass Sal die Zellmigration und -invasion einschränkt und einen Zyklusstillstand verursacht, indem es die Apoptose in den menschlichen Brustkrebs-MCF-7-Zellen fördert33,34. Es bleibt jedoch abzuwarten, ob Sal den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg regulieren und die maligne Proliferation von MCF-7-Zellen hemmen kann. Daher zielte dieses Protokoll darauf ab, die Auswirkungen von Sal auf die MCF-7-Zellmigration, -invasion, den Zellzyklus und die Apoptose über den PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-Signalweg zu untersuchen. Die integrierten Forschungsstrategien, die konventionelle, kostengünstige und unabhängige Experimente umfassen, wie z. B. Zellmigrations- und Invasionsbewertungen, Apoptose und Zellzyklusnachweis durch Durchflusszytometrie, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Ca2+ Fluoreszenzbestimmung usw., können eine Referenz für das Gesamtdesign von Experimenten zur Krebsforschung mit traditioneller Pflanzenmedizin bieten. Der experimentelle Ablauf dieser Studie ist in Abbildung 1 dargestellt.

Protocol

Die für die vorliegende Studie verwendeten MCF-7-Zellen wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle). 1. Zellkultur Die MCF-7-Zellen werden in einer befeuchteten 5%igen CO2 -Atmosphäre bei 37 °C mit DMEM kultiviert, das 10 % FBS und 1 % Penicillin (10.000 U/ml)/Streptomycin (10.000 μg/ml) enthält (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Die Zellen, die 90 % des Bodens der Schale bedeckten, wurden …

Representative Results

Auswirkungen von Sal auf die Hemmung der übermäßigen Proliferation und die Verzögerung der Wundheilung in MCF-7-ZellenUm das Potenzial von Sal gegen Brustkrebs zu untersuchen, testeten wir zunächst seine krebshemmenden Eigenschaften mit Hilfe von Zellproliferationstoxizität und Scratch-Assays der menschlichen Brustkrebs-MCF-7-Zelllinie. Diese Zellen wurden mit einer Konzentrationsreihe von Sal (5-320 μM) für 24 h co-inkubiert, und die Zellproliferation wurde mit einem CCK-8-Assay bewertet. Es…

Discussion

Brustkrebs betrifft Menschen jeden Alters und verursacht unkalkulierbare körperliche und seelische Belastungen und einen großen wirtschaftlichen Druck1. Brustkrebs mit seiner von Jahr zu Jahr steigenden Morbidität und Mortalität hat auch weltweite Aufmerksamkeit auf sich gezogen, wenn es darum geht, wirksame pflanzliche Therapien zu finden, die über herkömmliche Behandlungen hinausgehen 4,5. Vielversprechend ist, dass eine große Anz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Gesundheitskommission der Provinz Sichuan (120025) unterstützt.

Materials

1% penicillin/streptomycin HyClone SV30010
AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT0185
Annexin V-FITC/PI kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. AP101
Automatic microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
Bax antibody Cell Signaling Technology, Inc. #5023
BCA kit Biosharp Life Sciences BL521A
Bcl-2 antibody Cell Signaling Technology, Inc. #15071
Bim antibody Cell Signaling Technology, Inc. #2933
Ca2+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-4-2
Cell counting kit-8 Biosharp Life Sciences BS350B
Cell cycle staining kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. CCS012
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technology, Inc. #9661
cleaved caspase-7 Cell Signaling Technology, Inc. #8438
cleaved caspase-9 Cell Signaling Technology, Inc. #20750
Crystal violet solution Beyotime Biotechnology C0121
DMEM high glucose culture medium Servicebio Technology Co., Ltd. G4510
Doxorubicin hydrochloride MedChemExpress HY-15142
ECL chemiluminescent solution Biosharp Life Sciences BL520B
Fetal bovine serum Procell Life Science & Technology Co., Ltd. 164210
Flow cytometer BD FACSCanto Equation 1
Fluo-4 AM Beyotime Biotechnology S1060
FoxO1 antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody MultiSciences Biotech Co., Ltd. 70-GAR0072
GraphPad Prism software La Jolla Version 6.0
HIF-1α antibody Affinity Biosciences BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7 Procell Life Science & Technology Co., Ltd. CL-0149
Loading buffer Biosharp Life Sciences BL502B
LY294002 MedChemExpress HY-10108
Matrigel Thermo  356234
mTOR antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-2-2
Optical microscope Olympus IX71PH
p-AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YP0006
PI3K antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11525
p-PI3K antibody Affinity Biosciences AF3241
Quantitative western blot imaging system Touch Image Pro eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit Servicebio Technology Co., Ltd. G3330-100
ROS assay kit Beyotime Biotechnology S0033S DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside Chengdu Herbpurify Co., Ltd. H-040
SDS-PAGE kit Servicebio Technology Co., Ltd. G2003-50T
Total RNA isolation kit Foregene RE-03014
Trypsin HyClone SH30042.01
β-actin Affinity Biosciences AF7018
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References

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Keywords: SalidrosideMCF-7 CellsBreast CancerPI3K/AKT/HIF-1α/FoxO1 SignalingProliferationMigrationInvasionApoptosisCell CycleROSCa2+Na+-K+-ATPaseCa2+-ATPase
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Cui, L., Ye, C., Luo, T., Jiang, H., Lai, B., Wang, H., Chen, Z., Li, Y. Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration. J. Vis. Exp. (196), e65634, doi:10.3791/65634 (2023).
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