Exploration de l’action pharmacologique et du mécanisme moléculaire du salidroside dans l’inhibition de la prolifération et de la migration des cellules MCF-7
Summary
Le présent protocole décrit une stratégie globale pour évaluer l’action pharmacologique et le mécanisme du salidroside dans l’inhibition de la prolifération et de la migration des cellules MCF-7.
Abstract
Le salidroside (Sal) contient des activités pharmacologiques anti-cancérigènes, anti-hypoxiques et anti-inflammatoires. Cependant, ses mécanismes sous-jacents anti-cancer du sein n’ont été qu’incomplètement élucidés. Par conséquent, ce protocole visait à décoder le potentiel de Sal dans la régulation de la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 dans la prolifération maligne des cellules MCF-7 du cancer du sein humain. Tout d’abord, l’activité pharmacologique de Sal contre MCF-7 a été évaluée par des tests CCK-8 et des tests de grattage cellulaire. De plus, la résistance des cellules MCF-7 a été mesurée par des tests de migration et d’invasion de Matrigel. Pour les tests d’apoptose cellulaire et de cycle, les cellules MCF-7 ont été traitées par étapes avec l’annexine V-FITC/PI et les kits de détection de coloration du cycle cellulaire pour les analyses de cytométrie en flux, respectivement. Les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de Ca2+ ont été examinés par coloration par immunofluorescence DCFH-DA et Fluo-4 AM. Les activités de Na+-K+-ATPase et de Ca2+-ATPase ont été déterminées à l’aide des kits commerciaux correspondants. Les niveaux d’expression des protéines et des gènes dans l’apoptose et la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 ont été déterminés à l’aide d’analyses Western blot et qRT-PCR, respectivement. Nous avons constaté que le traitement par Sal limitait considérablement la prolifération, la migration et l’invasion des cellules MCF-7 avec des effets dose-dépendants. Pendant ce temps, l’administration de Sal a également forcé de manière spectaculaire les cellules MCF-7 à subir l’apoptose et l’arrêt du cycle cellulaire. Les tests d’immunofluorescence ont montré que Sal stimulait de manière observable la production de ROS et de Ca2+ dans les cellules MCF-7. D’autres données ont confirmé que Sal a favorisé les niveaux d’expression des protéines pro-apoptotiques, Bax, Bim, caspase-9/7/3 clivée et de leurs gènes correspondants. De manière constante, l’intervention de Sal a considérablement réduit l’expression des protéines Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α et FoxO1 et de leurs gènes correspondants. En conclusion, le Sal peut être utilisé comme composé potentiel dérivé d’herbes pour le traitement du cancer du sein, car il peut réduire la prolifération maligne, la migration et l’invasion des cellules MCF-7 en inhibant la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
Introduction
En tant que l’un des cancers les plus fréquemment diagnostiqués et des tumeurs malignes les plus courantes, les dernières statistiques indiquent que 2,3 millions de cas de cancer du sein sont apparus dans le monde en 2020, ce qui représente 11,7 % de tous les cas de cancer1. Les symptômes courants du cancer du sein comprennent la sensibilité et les picotements des seins, les bosses et la douleur mammaires, l’écoulement du mamelon, l’érosion ou l’enfoncement de la peau et l’hypertrophie des ganglions lymphatiques axillaires 1,2. Plus alarmant encore, le nombre de nouveaux cas et l’incidence globale du cancer du sein continuent d’augmenter à un rythme effréné chaque année, représentant 6,9 % des décès liés au cancer1. À l’heure actuelle, l’intervention contre le cancer du sein implique encore principalement la chimiothérapie, la chirurgie, la radiothérapie et un traitement complet. Bien que le traitement puisse réduire efficacement le taux de récidive et le taux de mortalité des patients, l’application d’un traitement à long terme entraîne souvent une multirésistance aux médicaments, une perte de cheveux sur de grandes surfaces, des nausées et des vomissements, ainsi qu’une charge mentale et psychologique grave 2,3. Notamment, le risque potentiel de métastases d’organes multiples du cancer du sein oblige également les gens à rechercher de nouvelles sources de traitement médicamenteux à base de plantes 4,5.
La signalisation médiée par la phosphoinositide 3 kinase (PI3K) est impliquée dans la croissance, la prolifération et la survie du cancer du sein par épissage qui affecte l’expression de plusieurs gènes6. En tant que protéine de détection de signal en aval de PI3K, de nombreuses preuves suggèrent que la protéine kinase B (AKT) pourrait se coupler avec la protéine cible de la rapamycine (mTOR) chez les mammifères pour augmenter davantage le cancer du sein 7,8,9. De plus, la désactivation de la signalisation PI3K/AKT/mTOR a également été revendiquée comme étant un élément clé dans les médicaments inhibant la prolifération maligne et stimulant l’apoptose dans le cancer du sein10,11,12. Il est bien connu qu’une hypoxie extrême dans le microenvironnement tumoral entraîne une augmentation massive du facteur 1 alpha inductible par l’hypoxie (HIF-1α), ce qui aggrave encore la progression du cancer du sein13,14,15. En parallèle, la stimulation AKT conduit également à une accumulation excessive de HIF-1α, limitant l’apoptose dans les échantillons de cancer du sein16,17. Il est intéressant de noter que l’activation de la signalisation PI3K-AKT-HIF-1α a été confirmée comme étant impliquée dans la progression pathologique et les métastases dans une variété de cancers, y compris le cancer du poumon18, le cancer colorectal19, le cancer de l’ovaire20 et le cancer de la prostate21. En plus d’être orchestrée par HIF-1α, la surexpression du facteur de transcription 1 (FoxO1) est également déclenchée par la stimulation de la signalisation AKT, qui favorise l’arrêt du cycle et l’inhibition de l’apoptose dans les cellules cancéreuses du sein22,23. Ensemble, les preuves solides ci-dessus suggèrent que l’inhibition de la cascade de signalisation PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 pourrait être une nouvelle cible potentielle pour le traitement médicamenteux du cancer du sein.
Il a été largement démontré que le salidroside (Sal) exerce des activités anticancéreuses24,25, anti-hypoxie26,27,28,29 et des activités pharmacologiques immunostimulantes30. Il s’agit d’une poudre brun clair ou brune facilement soluble dans l’eau, est un type de glycoside phényléthanoïde et a une structure chimique de formule C14H 20 O7 et un poids moléculaire de300,331,32. Des études pharmacologiques modernes ont démontré que Sal peut favoriser l’apoptose des cellules cancéreuses gastriques en restreignant la signalisation PI3K-AKT-mTOR24. D’autres preuves suggèrent également que la suppression de la signalisation PI3K-AKT-HIF-1α par le traitement Sal peut contribuer à l’apoptose des cellules cancéreuses en augmentant leur sensibilité aux agents chimiothérapeutiques25. Les preuves suggèrent également que Sal restreint la migration et l’invasion cellulaires et provoque l’arrêt du cycle en favorisant l’apoptose dans les cellules MCF-7 du cancer du sein humain33,34. Cependant, il reste à voir si Sal peut réguler la signalisation PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 et inhiber la prolifération maligne des cellules MCF-7. Par conséquent, ce protocole visait à explorer les effets de Sal sur la migration, l’invasion, le cycle cellulaire et l’apoptose des cellules MCF-7 via la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Les stratégies de recherche intégrées comprenant des expériences conventionnelles, peu coûteuses et indépendantes, telles que les évaluations de la migration et de l’invasion cellulaires, la détection de l’apoptose et du cycle cellulaire par cytométrie en flux, la détermination des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de la fluorescence du Ca2+, etc., peuvent fournir une référence pour la conception globale des expériences pour la recherche anticancéreuse avec la phytothérapie traditionnelle. Le processus expérimental de cette étude est illustré à la figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cancer du sein touche des personnes de tous âges et entraîne un fardeau physique et mental incalculable ainsi qu’une grande pression économique1. Le cancer du sein, dont la morbidité et la mortalité augmentent chaque année, a également attiré l’attention du monde entier en termes de recherche de thérapies composées efficaces à base de plantes au-delà des traitements conventionnels 4,5. De manière prometteuse, un grand n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Commission de la santé de la province du Sichuan (120025).
Materials
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
- Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
- Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
- Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
- Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. 암 연구학. 82 (12), 2269-2280 (2022).
- Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
- Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
- Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
- Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
- Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
- Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
- Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
- You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
- La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
- Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
- Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
- Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
- Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
- Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
- Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
- Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
- Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
- Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
- Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
- Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
- Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
- Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
- Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
- Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research – Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
- Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
- Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
- Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
- Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).
