Настоящий протокол описывает комплексную стратегию оценки фармакологического действия и механизма салидрозида в ингибировании пролиферации и миграции клеток MCF-7.
Салидрозид (Sal) обладает антиканцерогенной, антигипоксической и противовоспалительной фармакологической активностью. Тем не менее, лежащие в его основе механизмы борьбы с раком молочной железы были выяснены лишь до конца. Таким образом, этот протокол был направлен на расшифровку потенциала Sal в регуляции пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 в злокачественной пролиферации клеток MCF-7 рака молочной железы человека. Во-первых, фармакологическую активность Sal в отношении MCF-7 оценивали с помощью CCK-8 и клеточного скретч-анализа. Кроме того, резистентность клеток MCF-7 была измерена с помощью анализов миграции и инвазии Матригеля. Для клеточного апоптоза и циклических анализов клетки MCF-7 обрабатывали поэтапно с помощью аннексина V-FITC/PI и наборов для обнаружения окрашивания клеточного цикла для анализа проточной цитометрии, соответственно. Уровни активных форм кислорода (АФК) иCa2+ исследовали методом иммунофлуоресцентного окрашивания DCFH-DA и Fluo-4 AM. Активность Na+-K+-АТФазы и Ca2+-АТФазы определяли с помощью соответствующих коммерческих наборов. Уровни экспрессии белков и генов в апоптозе и пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 дополнительно определяли с помощью вестерн-блоттинга и qRT-ПЦР-анализа соответственно. Мы обнаружили, что лечение Sal значительно ограничивало пролиферацию, миграцию и инвазию клеток MCF-7 с дозозависимыми эффектами. Между тем, введение Sal также резко заставляло клетки MCF-7 подвергаться апоптозу и остановке клеточного цикла. Иммунофлуоресцентные тесты показали, что Sal наблюдаемо стимулирует продукцию АФК иCa2+ в клетках MCF-7. Дальнейшие данные подтвердили, что Sal способствовал уровню экспрессии проапоптотических белков, Bax, Bim, расщепленной каспазы-9/7/3 и соответствующих им генов. Последовательно вмешательство Sal заметно снижало экспрессию белков Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α и FoxO1 и соответствующих им генов. В заключение, Sal может быть использован в качестве потенциального растительного соединения для лечения рака молочной железы, поскольку он может уменьшить злокачественную пролиферацию, миграцию и инвазию клеток MCF-7 путем ингибирования пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
Как один из наиболее часто диагностируемых видов рака и наиболее распространенных злокачественных новообразований, последние статистические данные показывают, что к 2020 году во всем мире возникло 2,3 миллиона случаев рака молочной железы, что составляет 11,7%всех случаев рака. Общие симптомы рака молочной железы включают болезненность и покалывание в груди, уплотнения и боль в груди, выделения из сосков, эрозию или впалую кожу, а также увеличение подмышечных лимфатических узлов 1,2. Еще большую тревогу вызывает тот факт, что число новых случаев заболевания и общая заболеваемость раком молочной железы продолжают расти с огромной скоростью каждый год, составляя 6,9% смертей, связанных с раком1. В настоящее время вмешательство при раке молочной железы по-прежнему в основном включает химиотерапию, хирургическое вмешательство, лучевую терапию и комплексное лечение. Несмотря на то, что лечение может эффективно снизить частоту рецидивов и смертность пациентов, длительное применение лечения часто приводит к множественной лекарственной устойчивости, выпадению волос на большой площади, тошноте и рвоте, а также серьезной психической и психологической нагрузке 2,3. Примечательно, что потенциальный риск метастазов в несколько органов при раке молочной железы также вынуждает людей искать новые растительные источники лекарственной терапии 4,5.
Фосфоинозитид-3-киназная (PI3K)-опосредованная передача сигналов участвует в росте, пролиферации и выживаемости рака молочной железы посредством сплайсинга, который влияет на экспрессию нескольких генов6. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что протеинкиназа B (AKT) может соединяться с мишенью рапамицина (mTOR) млекопитающих для дальнейшего увеличения заболеваемости раком молочной железы 7,8,9. Кроме того, деактивация передачи сигналов PI3K/AKT/mTOR также считается ключевым компонентом препаратов, ингибирующих злокачественную пролиферацию и стимулирующих апоптоз при раке молочной железы10,11,12. Хорошо известно, что крайняя гипоксия в микроокружении опухоли вызывает массивный всплеск гипоксически-индуцируемого фактора 1 альфа (HIF-1α), что еще больше ухудшает прогрессирование рака молочной железы13,14,15. Параллельно стимуляция AKT также приводит к избыточному накоплению HIF-1α, ограничивая апоптоз в образцах рака молочной железы16,17. Интересно, что было подтверждено, что активация передачи сигналов PI3K-AKT-HIF-1α участвует в патологическом прогрессировании и метастазировании при различных видах рака, включая рак легких18, колоректальный рак19, рак яичников20 и рак простаты21. В дополнение к тому, что гиперэкспрессия фактора транскрипции 1 (FoxO1) раздвоенной головки также вызывается стимуляцией сигналов AKT, которая способствует остановке цикла и ингибированию апоптоза в клетках рака молочной железы22,23. В совокупности приведенные выше убедительные данные свидетельствуют о том, что ингибирование каскада передачи сигналов PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 может быть потенциальной новой мишенью для лекарственной терапии при раке молочной железы.
Широко продемонстрировано, что салидрозид (Sal) обладает противораковой24,25, антигипоксией26,27,28,29 и иммуностимулирующей фармакологической активностью30. Это светло-коричневый или коричневый порошок, который легко растворяется в воде, является разновидностью фенилэтанового гликозида и имеет формулу химической структуры C14H 20 O7 и молекулярную массу300,331,32. Современные фармакологические исследования показали, что Sal может способствовать апоптозу клеток рака желудка, сдерживая передачу сигналов PI3K-AKT-mTOR24. Дальнейшие данные также свидетельствуют о том, что подавление передачи сигналов PI3K-AKT-HIF-1α с помощью лечения Sal может способствовать апоптозу раковых клеток, повышая их чувствительность к химиотерапевтическим агентам25. Данные также свидетельствуют о том, что Sal ограничивает миграцию и инвазию клеток и вызывает остановку цикла, способствуя апоптозу в клетках MCF-7 рака молочной железы человека33,34. Тем не менее, еще предстоит выяснить, может ли Sal регулировать передачу сигналов PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 и ингибировать злокачественную пролиферацию клеток MCF-7. Таким образом, этот протокол был направлен на изучение влияния Sal на миграцию клеток MCF-7, инвазию, клеточный цикл и апоптоз через путь PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Интегрированные исследовательские стратегии, включающие традиционные, недорогие и независимые эксперименты, такие как оценка миграции и инвазии клеток, определение апоптоза и клеточного цикла с помощью проточной цитометрии, определение активных форм кислорода (АФК) и флуоресценцииCa2+ и т. д., могут служить ориентиром для общего планирования экспериментов по противораковым исследованиям с использованием традиционной фитотерапии. Экспериментальный процесс данного исследования показан на рисунке 1.
Рак молочной железы поражает людей всех возрастов и вызывает неисчислимое физическое и психическое бремя, а также большое экономическое давление1. Рак молочной железы с его растущей заболеваемостью и смертностью с каждым годом также привлек внимание всего мира с точки зр?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Комиссией по здравоохранению провинции Сычуань (120025).
1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
Flow cytometer | BD | FACSCanto ![]() |
|
Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
Matrigel | Thermo | 356234 | |
mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |