JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Изучение фармакологического действия и молекулярного механизма салидрозида в ингибировании пролиферации и миграции клеток MCF-7

Published: June 09, 2023
doi:
10.3791/65634
, , , , , , ,
1Pathology Department,Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery,the Third People’s Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

Summary

Настоящий протокол описывает комплексную стратегию оценки фармакологического действия и механизма салидрозида в ингибировании пролиферации и миграции клеток MCF-7.

Abstract

Салидрозид (Sal) обладает антиканцерогенной, антигипоксической и противовоспалительной фармакологической активностью. Тем не менее, лежащие в его основе механизмы борьбы с раком молочной железы были выяснены лишь до конца. Таким образом, этот протокол был направлен на расшифровку потенциала Sal в регуляции пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 в злокачественной пролиферации клеток MCF-7 рака молочной железы человека. Во-первых, фармакологическую активность Sal в отношении MCF-7 оценивали с помощью CCK-8 и клеточного скретч-анализа. Кроме того, резистентность клеток MCF-7 была измерена с помощью анализов миграции и инвазии Матригеля. Для клеточного апоптоза и циклических анализов клетки MCF-7 обрабатывали поэтапно с помощью аннексина V-FITC/PI и наборов для обнаружения окрашивания клеточного цикла для анализа проточной цитометрии, соответственно. Уровни активных форм кислорода (АФК) иCa2+ исследовали методом иммунофлуоресцентного окрашивания DCFH-DA и Fluo-4 AM. Активность Na+-K+-АТФазы и Ca2+-АТФазы определяли с помощью соответствующих коммерческих наборов. Уровни экспрессии белков и генов в апоптозе и пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 дополнительно определяли с помощью вестерн-блоттинга и qRT-ПЦР-анализа соответственно. Мы обнаружили, что лечение Sal значительно ограничивало пролиферацию, миграцию и инвазию клеток MCF-7 с дозозависимыми эффектами. Между тем, введение Sal также резко заставляло клетки MCF-7 подвергаться апоптозу и остановке клеточного цикла. Иммунофлуоресцентные тесты показали, что Sal наблюдаемо стимулирует продукцию АФК иCa2+ в клетках MCF-7. Дальнейшие данные подтвердили, что Sal способствовал уровню экспрессии проапоптотических белков, Bax, Bim, расщепленной каспазы-9/7/3 и соответствующих им генов. Последовательно вмешательство Sal заметно снижало экспрессию белков Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α и FoxO1 и соответствующих им генов. В заключение, Sal может быть использован в качестве потенциального растительного соединения для лечения рака молочной железы, поскольку он может уменьшить злокачественную пролиферацию, миграцию и инвазию клеток MCF-7 путем ингибирования пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introduction

Как один из наиболее часто диагностируемых видов рака и наиболее распространенных злокачественных новообразований, последние статистические данные показывают, что к 2020 году во всем мире возникло 2,3 миллиона случаев рака молочной железы, что составляет 11,7%всех случаев рака. Общие симптомы рака молочной железы включают болезненность и покалывание в груди, уплотнения и боль в груди, выделения из сосков, эрозию или впалую кожу, а также увеличение подмышечных лимфатических узлов 1,2. Еще большую тревогу вызывает тот факт, что число новых случаев заболевания и общая заболеваемость раком молочной железы продолжают расти с огромной скоростью каждый год, составляя 6,9% смертей, связанных с раком1. В настоящее время вмешательство при раке молочной железы по-прежнему в основном включает химиотерапию, хирургическое вмешательство, лучевую терапию и комплексное лечение. Несмотря на то, что лечение может эффективно снизить частоту рецидивов и смертность пациентов, длительное применение лечения часто приводит к множественной лекарственной устойчивости, выпадению волос на большой площади, тошноте и рвоте, а также серьезной психической и психологической нагрузке 2,3. Примечательно, что потенциальный риск метастазов в несколько органов при раке молочной железы также вынуждает людей искать новые растительные источники лекарственной терапии 4,5.

Фосфоинозитид-3-киназная (PI3K)-опосредованная передача сигналов участвует в росте, пролиферации и выживаемости рака молочной железы посредством сплайсинга, который влияет на экспрессию нескольких генов6. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что протеинкиназа B (AKT) может соединяться с мишенью рапамицина (mTOR) млекопитающих для дальнейшего увеличения заболеваемости раком молочной железы 7,8,9. Кроме того, деактивация передачи сигналов PI3K/AKT/mTOR также считается ключевым компонентом препаратов, ингибирующих злокачественную пролиферацию и стимулирующих апоптоз при раке молочной железы10,11,12. Хорошо известно, что крайняя гипоксия в микроокружении опухоли вызывает массивный всплеск гипоксически-индуцируемого фактора 1 альфа (HIF-1α), что еще больше ухудшает прогрессирование рака молочной железы13,14,15. Параллельно стимуляция AKT также приводит к избыточному накоплению HIF-1α, ограничивая апоптоз в образцах рака молочной железы16,17. Интересно, что было подтверждено, что активация передачи сигналов PI3K-AKT-HIF-1α участвует в патологическом прогрессировании и метастазировании при различных видах рака, включая рак легких18, колоректальный рак19, рак яичников20 и рак простаты21. В дополнение к тому, что гиперэкспрессия фактора транскрипции 1 (FoxO1) раздвоенной головки также вызывается стимуляцией сигналов AKT, которая способствует остановке цикла и ингибированию апоптоза в клетках рака молочной железы22,23. В совокупности приведенные выше убедительные данные свидетельствуют о том, что ингибирование каскада передачи сигналов PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 может быть потенциальной новой мишенью для лекарственной терапии при раке молочной железы.

Широко продемонстрировано, что салидрозид (Sal) обладает противораковой24,25, антигипоксией26,27,28,29 и иммуностимулирующей фармакологической активностью30. Это светло-коричневый или коричневый порошок, который легко растворяется в воде, является разновидностью фенилэтанового гликозида и имеет формулу химической структуры C14H 20 O7 и молекулярную массу300,331,32. Современные фармакологические исследования показали, что Sal может способствовать апоптозу клеток рака желудка, сдерживая передачу сигналов PI3K-AKT-mTOR24. Дальнейшие данные также свидетельствуют о том, что подавление передачи сигналов PI3K-AKT-HIF-1α с помощью лечения Sal может способствовать апоптозу раковых клеток, повышая их чувствительность к химиотерапевтическим агентам25. Данные также свидетельствуют о том, что Sal ограничивает миграцию и инвазию клеток и вызывает остановку цикла, способствуя апоптозу в клетках MCF-7 рака молочной железы человека33,34. Тем не менее, еще предстоит выяснить, может ли Sal регулировать передачу сигналов PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 и ингибировать злокачественную пролиферацию клеток MCF-7. Таким образом, этот протокол был направлен на изучение влияния Sal на миграцию клеток MCF-7, инвазию, клеточный цикл и апоптоз через путь PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Интегрированные исследовательские стратегии, включающие традиционные, недорогие и независимые эксперименты, такие как оценка миграции и инвазии клеток, определение апоптоза и клеточного цикла с помощью проточной цитометрии, определение активных форм кислорода (АФК) и флуоресценцииCa2+ и т. д., могут служить ориентиром для общего планирования экспериментов по противораковым исследованиям с использованием традиционной фитотерапии. Экспериментальный процесс данного исследования показан на рисунке 1.

Protocol

Клетки MCF-7, использованные в настоящем исследовании, были получены из коммерческого источника (см. таблицу материалов). 1. Клеточная культура Культивирование клеток MCF-7 в увлажненной атмосфере 5% CO2 при 37 °C с DMEM, содержащим 10% FBS и 1% пенициллина (1…

Representative Results

Влияние Sal на ингибирование избыточной пролиферации и замедление заживления ран в клетках MCF-7Чтобы исследовать потенциал Sal против рака молочной железы, мы сначала проверили его противоопухолевые свойства, используя токсичность пролиферации клеток и скретч-анализы клеточ?…

Discussion

Рак молочной железы поражает людей всех возрастов и вызывает неисчислимое физическое и психическое бремя, а также большое экономическое давление1. Рак молочной железы с его растущей заболеваемостью и смертностью с каждым годом также привлек внимание всего мира с точки зр?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Комиссией по здравоохранению провинции Сычуань (120025).

Materials

1% penicillin/streptomycin HyClone SV30010
AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT0185
Annexin V-FITC/PI kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. AP101
Automatic microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
Bax antibody Cell Signaling Technology, Inc. #5023
BCA kit Biosharp Life Sciences BL521A
Bcl-2 antibody Cell Signaling Technology, Inc. #15071
Bim antibody Cell Signaling Technology, Inc. #2933
Ca2+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-4-2
Cell counting kit-8 Biosharp Life Sciences BS350B
Cell cycle staining kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. CCS012
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technology, Inc. #9661
cleaved caspase-7 Cell Signaling Technology, Inc. #8438
cleaved caspase-9 Cell Signaling Technology, Inc. #20750
Crystal violet solution Beyotime Biotechnology C0121
DMEM high glucose culture medium Servicebio Technology Co., Ltd. G4510
Doxorubicin hydrochloride MedChemExpress HY-15142
ECL chemiluminescent solution Biosharp Life Sciences BL520B
Fetal bovine serum Procell Life Science & Technology Co., Ltd. 164210
Flow cytometer BD FACSCanto Equation 1
Fluo-4 AM Beyotime Biotechnology S1060
FoxO1 antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody MultiSciences Biotech Co., Ltd. 70-GAR0072
GraphPad Prism software La Jolla Version 6.0
HIF-1α antibody Affinity Biosciences BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7 Procell Life Science & Technology Co., Ltd. CL-0149
Loading buffer Biosharp Life Sciences BL502B
LY294002 MedChemExpress HY-10108
Matrigel Thermo  356234
mTOR antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-2-2
Optical microscope Olympus IX71PH
p-AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YP0006
PI3K antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11525
p-PI3K antibody Affinity Biosciences AF3241
Quantitative western blot imaging system Touch Image Pro eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit Servicebio Technology Co., Ltd. G3330-100
ROS assay kit Beyotime Biotechnology S0033S DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside Chengdu Herbpurify Co., Ltd. H-040
SDS-PAGE kit Servicebio Technology Co., Ltd. G2003-50T
Total RNA isolation kit Foregene RE-03014
Trypsin HyClone SH30042.01
β-actin Affinity Biosciences AF7018
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
  3. Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
  4. Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
  5. Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
  6. Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. 암 연구학. 82 (12), 2269-2280 (2022).
  7. Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
  8. Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
  9. Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
  10. Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
  11. Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
  12. Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
  13. Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
  14. You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
  15. La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
  16. Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
  17. Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
  18. Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
  19. Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
  20. Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
  21. Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
  22. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
  23. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
  24. Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
  25. Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
  26. Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  27. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
  28. Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
  29. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
  30. Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
  31. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  32. Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
  33. Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
  34. Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
  35. Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
  36. Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
  37. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
  38. Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research – Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
  39. Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
  40. Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
  41. Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
  42. Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).

Tags

SalidrosideMCF-7 CellsBreast CancerPI3K/AKT/HIF-1α/FoxO1 SignalingProliferationMigrationInvasionApoptosisCell CycleROSCa2+Na+-K+-ATPaseCa2+-ATPase

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cui, L., Ye, C., Luo, T., Jiang, H., Lai, B., Wang, H., Chen, Z., Li, Y. Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration. J. Vis. Exp. (196), e65634, doi:10.3791/65634 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image