JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
의학

Undersøgelse af salidrosids farmakologiske virkning og molekylære mekanisme til hæmning af MCF-7-celleproliferation og migration

Published: June 09, 2023
doi:
10.3791/65634
, , , , , , ,
1Pathology Department,Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery,the Third People’s Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

Summary

Denne protokol beskriver en omfattende strategi til evaluering af salidrosids farmakologiske virkning og mekanisme til hæmning af MCF-7-celleproliferation og migration.

Abstract

Salidrosid (Sal) indeholder anti-kræftfremkaldende, anti-hypoxiske og antiinflammatoriske farmakologiske aktiviteter. Imidlertid er dets underliggende anti-brystkræftmekanismer kun blevet ufuldstændigt belyst. Derfor havde denne protokol til hensigt at afkode Sal’s potentiale til regulering af PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vejen i den ondartede spredning af humane brystkræft MCF-7-celler. For det første blev den farmakologiske aktivitet af Sal mod MCF-7 evalueret ved CCK-8 og celleridseassays. Desuden blev modstanden af MCF-7-celler målt ved migrations- og Matrigel invasionsassays. Til celleapoptose og cyklusassays blev MCF-7-celler behandlet i trin med annexin V-FITC / PI og cellecyklusfarvningsdetektionssæt til henholdsvis flowcytometrianalyser. Niveauerne af reaktive iltarter (ROS) og Ca2+ blev undersøgt ved DCFH-DA og Fluo-4 AM immunfluorescensfarvning. Aktiviteterne i Na+-K+-ATPase og Ca2+-ATPase blev bestemt ved hjælp af de tilsvarende kommercielle kits. Protein- og genekspressionsniveauerne i apoptose og PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vejen blev yderligere bestemt ved hjælp af henholdsvis western blot- og qRT-PCR-analyser. Vi fandt, at Sal-behandling signifikant begrænsede spredning, migration og invasion af MCF-7-celler med dosisafhængige virkninger. I mellemtiden tvang Sal-administrationen også dramatisk MCF-7-celler til at gennemgå apoptose og cellecyklusstop. Immunofluorescenstestene viste, at Sal observerbart stimulerede ROS og Ca2+ produktion i MCF-7 celler. Yderligere data bekræftede, at Sal fremmede ekspressionsniveauerne af pro-apoptotiske proteiner, Bax, Bim, spaltet caspase-9/7/3 og deres tilsvarende gener. Konsekvent reducerede Sal-intervention fremtrædende ekspressionen af proteinerne Bcl-2, p-PI3K / PI3K, p-AKT / AKT, mTOR, HIF-1α og FoxO1 og deres tilsvarende gener. Afslutningsvis kan Sal bruges som en potentiel urteafledt forbindelse til behandling af brystkræft, da det kan reducere den ondartede spredning, migration og invasion af MCF-7-celler ved at hæmme PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-vejen.

Introduction

Som en af de mest almindeligt diagnosticerede kræftformer og mest almindelige maligniteter viser de seneste statistikker, at 2,3 millioner tilfælde af brystkræft opstod rundt om i verden i 2020, hvilket tegner sig for 11,7% af alle kræfttilfælde1. Almindelige symptomer på brystkræft omfatter ømhed og prikken i brystet, knuder og smerter i brystet, udflåd fra brystvorten, erosion eller sunket hud og forstørrede aksillære lymfeknuder 1,2. Endnu mere alarmerende er det, at antallet af nye tilfælde og den samlede forekomst af brystkræft fortsætter med at stige med en overvældende hastighed hvert år og tegner sig for 6,9% af kræftrelaterede dødsfald1. På nuværende tidspunkt involverer brystkræftintervention stadig hovedsageligt kemoterapi, kirurgi, strålebehandling og omfattende behandling. Selvom behandling effektivt kan reducere patienternes tilbagefaldsrate og dødelighed, forårsager langvarig behandlingsanvendelse ofte multiresistens, hårtab i store områder, kvalme og opkastning og alvorlig mental og psykologisk byrde 2,3. Især tvinger den potentielle risiko for flere organmetastaser fra brystkræft også folk til at søge nye urtekilder til lægemiddelterapi 4,5.

Phosphoinositid 3-kinase (PI3K)-medieret signalering er impliceret i vækst, spredning og overlevelse af brystkræft gennem splejsning, der påvirker ekspressionen af flere gener6. Som et nedstrøms signalfølende protein af PI3K tyder mange beviser på, at proteinkinase B (AKT) kunne parres med pattedyrsmålet for rapamycin (mTOR) protein for yderligere at øge brystkræft 7,8,9. Desuden er deaktivering af PI3K / AKT / mTOR-signalering også blevet hævdet at være en nøglekomponent i lægemidler, der hæmmer ondartet proliferation og stimulerer apoptose i brystkræft10,11,12. Det er velkendt, at ekstrem hypoxi i tumormikromiljøet tvinger en massiv stigning i hypoxi-inducerbar faktor 1 alfa (HIF-1α), hvilket yderligere forværrer udviklingen af brystkræft13,14,15. Parallelt fører AKT-stimulering også til overdreven ophobning af HIF-1a, hvilket begrænser apoptose i brystkræftprøver16,17. Interessant nok er aktiveringen af PI3K-AKT-HIF-1α-signalering blevet bekræftet at være involveret i patologisk progression og metastase i en række kræftformer, herunder lungekræft18, kolorektal cancer19, kræft i æggestokkene20 og prostatacancer21. Ud over at være orkestreret af HIF-1α udløses gaffelhovedtranskriptionsfaktor 1 (FoxO1) overekspression også af AKT-signalstimulering, som fremmer cyklusstop og hæmning af apoptose i brystkræftceller22,23. Tilsammen tyder ovenstående solide beviser på, at hæmningen af kaskaden af PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering kan være et potentielt nyt mål for lægemiddelbehandling i brystkræft.

Salidrosid (Sal) har vist sig bredt at udøve anti-cancer 24,25, anti-hypoxi26,27,28,29 og immunforstærkende farmakologiske aktiviteter 30. Det er et lysebrunt eller brunt pulver, der er let opløseligt i vand, er en type phenylethanoidglycosid og har en kemisk strukturformel på C14H20O7 og en molekylvægt på300,331,32. Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at Sal kan fremme apoptose af gastriske kræftceller ved at begrænse PI3K-AKT-mTOR-signalering24. Yderligere beviser tyder også på, at undertrykkelsen af PI3K-AKT-HIF-1α-signalering ved Sal-behandling kan bidrage til apoptose af kræftceller ved at øge deres følsomhed over for kemoterapeutiske midler25. Beviser tyder også på, at Sal begrænser cellemigration og invasion og forårsager cyklusstop ved at fremme apoptose i de humane brystkræft MCF-7-celler33,34. Det er dog stadig at se, om Sal kan regulere PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-signalering og hæmme den ondartede proliferation af MCF-7-celler. Derfor havde denne protokol til formål at undersøge virkningerne af Sal på MCF-7-cellemigration, invasion, cellecyklus og apoptose via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vejen. De integrerede forskningsstrategier, der omfatter konventionelle, billige og uafhængige eksperimenter, såsom cellemigrations- og invasionsvurderinger, apoptose og cellecyklusdetektion ved flowcytometri, reaktive iltarter (ROS) og Ca2+ fluorescensbestemmelse osv., Kan give en reference for det overordnede design af eksperimenter til kræftforskning med traditionel urtemedicin. Den eksperimentelle proces i denne undersøgelse er vist i figur 1.

Protocol

MCF-7-cellerne, der blev anvendt til denne undersøgelse, blev opnået fra en kommerciel kilde (se materialetabellen). 1. Cellekultur Kultiver MCF-7-cellerne i en befugtet 5% CO2 atmosfære ved 37 °C med DMEM indeholdende 10% FBS og 1% penicillin (10.000 E / ml) / streptomycin (10.000 μg / ml) (se materialetabellen).BEMÆRK: Cellerne, der dækker 90% af bunden af skålen, blev anvendt til eksperimentet og tildelt fø…

Representative Results

Virkninger af Sal på hæmning af overskydende proliferation og forsinkelse af sårheling i MCF-7-cellerFor at undersøge potentialet i Sal mod brystkræft testede vi først dets kræftegenskaber ved hjælp af celleproliferationstoksicitet og ridseanalyser af MCF-7-cellelinjen for human brystkræft. Disse celler blev co-inkuberet med en koncentrationsserie af Sal (5-320 μM) i 24 timer, og celleproliferation blev evalueret ved hjælp af et CCK-8-assay. En dosisafhængig hæmmende virkning af Sal på …

Discussion

Brystkræft rammer personer i alle aldre og forårsager en uberegnelig fysisk og psykisk byrde og et stort økonomisk pres1. Brystkræft, med sin stigende sygelighed og dødelighed hvert år, har også tiltrukket verdensomspændende opmærksomhed med hensyn til at søge effektive urtebaserede sammensatte terapier ud over konventionelle behandlinger 4,5. Lovende har en stor mængde beviser afsløret anti-cancer virkningerne af Sal<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af sundhedskommissionen i Sichuan-provinsen (120025).

Materials

1% penicillin/streptomycin HyClone SV30010
AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT0185
Annexin V-FITC/PI kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. AP101
Automatic microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
Bax antibody Cell Signaling Technology, Inc. #5023
BCA kit Biosharp Life Sciences BL521A
Bcl-2 antibody Cell Signaling Technology, Inc. #15071
Bim antibody Cell Signaling Technology, Inc. #2933
Ca2+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-4-2
Cell counting kit-8 Biosharp Life Sciences BS350B
Cell cycle staining kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. CCS012
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technology, Inc. #9661
cleaved caspase-7 Cell Signaling Technology, Inc. #8438
cleaved caspase-9 Cell Signaling Technology, Inc. #20750
Crystal violet solution Beyotime Biotechnology C0121
DMEM high glucose culture medium Servicebio Technology Co., Ltd. G4510
Doxorubicin hydrochloride MedChemExpress HY-15142
ECL chemiluminescent solution Biosharp Life Sciences BL520B
Fetal bovine serum Procell Life Science & Technology Co., Ltd. 164210
Flow cytometer BD FACSCanto Equation 1
Fluo-4 AM Beyotime Biotechnology S1060
FoxO1 antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody MultiSciences Biotech Co., Ltd. 70-GAR0072
GraphPad Prism software La Jolla Version 6.0
HIF-1α antibody Affinity Biosciences BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7 Procell Life Science & Technology Co., Ltd. CL-0149
Loading buffer Biosharp Life Sciences BL502B
LY294002 MedChemExpress HY-10108
Matrigel Thermo  356234
mTOR antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-2-2
Optical microscope Olympus IX71PH
p-AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YP0006
PI3K antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11525
p-PI3K antibody Affinity Biosciences AF3241
Quantitative western blot imaging system Touch Image Pro eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit Servicebio Technology Co., Ltd. G3330-100
ROS assay kit Beyotime Biotechnology S0033S DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside Chengdu Herbpurify Co., Ltd. H-040
SDS-PAGE kit Servicebio Technology Co., Ltd. G2003-50T
Total RNA isolation kit Foregene RE-03014
Trypsin HyClone SH30042.01
β-actin Affinity Biosciences AF7018
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
  3. Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
  4. Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
  5. Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
  6. Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. 암 연구학. 82 (12), 2269-2280 (2022).
  7. Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
  8. Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
  9. Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
  10. Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
  11. Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
  12. Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
  13. Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
  14. You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
  15. La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
  16. Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
  17. Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
  18. Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
  19. Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
  20. Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
  21. Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
  22. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
  23. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
  24. Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
  25. Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
  26. Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  27. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
  28. Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
  29. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
  30. Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
  31. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  32. Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
  33. Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
  34. Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
  35. Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
  36. Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
  37. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
  38. Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research – Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
  39. Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
  40. Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
  41. Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
  42. Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).

Tags

Keywords: SalidrosideMCF-7 CellsBreast CancerPI3K/AKT/HIF-1α/FoxO1 SignalingProliferationMigrationInvasionApoptosisCell CycleROSCa2+Na+-K+-ATPaseCa2+-ATPase
check_url/kr/65634?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cui, L., Ye, C., Luo, T., Jiang, H., Lai, B., Wang, H., Chen, Z., Li, Y. Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration. J. Vis. Exp. (196), e65634, doi:10.3791/65634 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image