Het huidige protocol beschrijft een alomvattende strategie voor het evalueren van de farmacologische werking en het mechanisme van salidroside bij het remmen van de proliferatie en migratie van MCF-7-cellen.
Salidroside (Sal) bevat anticarcinogene, antihypoxische en ontstekingsremmende farmacologische activiteiten. De onderliggende anti-borstkankermechanismen zijn echter slechts onvolledig opgehelderd. Vandaar dat dit protocol bedoeld was om het potentieel van Sal te decoderen bij het reguleren van de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route in de kwaadaardige proliferatie van MCF-7-cellen van menselijke borstkanker. Ten eerste werd de farmacologische activiteit van Sal tegen MCF-7 geëvalueerd door middel van CCK-8- en celkrastesten. Bovendien werd de resistentie van MCF-7-cellen gemeten door middel van migratie- en Matrigel-invasietests. Voor celapoptose en cyclusassays werden MCF-7-cellen in stappen verwerkt met respectievelijk annexine V-FITC/PI en detectiekits voor celcycluskleuring voor flowcytometrieanalyses. De niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en Ca2+ werden onderzocht door middel van DCFH-DA en Fluo-4 AM immunofluorescentiekleuring. De activiteiten van Na+-K+-ATPase en Ca2+-ATPase werden bepaald met behulp van de bijbehorende commerciële kits. De eiwit- en genexpressieniveaus in apoptose en de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route werden verder bepaald met behulp van respectievelijk western blot- en qRT-PCR-analyses. We ontdekten dat Sal-behandeling de proliferatie, migratie en invasie van MCF-7-cellen aanzienlijk beperkte, met dosisafhankelijke effecten. Ondertussen dwong de toediening van Sal MCF-7-cellen ook dramatisch om apoptose en celcyclusstilstand te ondergaan. De immunofluorescentietests toonden aan dat Sal de productie van ROS en Ca2+ in MCF-7-cellen waarneembaar stimuleerde. Verdere gegevens bevestigden dat Sal de expressieniveaus van pro-apoptotische eiwitten, Bax, Bim, gespleten caspase-9/7/3 en hun overeenkomstige genen bevorderde. Consequent verminderde Sal-interventie prominent de expressie van de Bcl-2-, p-PI3K/PI3K-, p-AKT/AKT-, mTOR-, HIF-1α- en FoxO1-eiwitten en hun overeenkomstige genen. Concluderend kan Sal worden gebruikt als een potentiële van kruiden afgeleide verbinding voor de behandeling van borstkanker, omdat het de kwaadaardige proliferatie, migratie en invasie van MCF-7-cellen kan verminderen door de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route te remmen.
Als een van de meest gediagnosticeerde vormen van kanker en de meest voorkomende maligniteiten, geven de laatste statistieken aan dat er in 2020 wereldwijd 2,3 miljoen gevallen van borstkanker zijn ontstaan, goed voor 11,7% van alle gevallen vankanker1. Veel voorkomende symptomen van borstkanker zijn gevoelige en tintelingen in de borsten, knobbels en pijn in de borst, tepelafscheiding, erosie of ingevallen huid en vergrote oksellymfeklieren 1,2. Nog alarmerender is dat het aantal nieuwe gevallen en de totale incidentie van borstkanker elk jaar in een overweldigend tempo blijft toenemen, goed voor 6,9% van de kankergerelateerde sterfgevallen. Op dit moment bestaat de interventie bij borstkanker nog steeds voornamelijk uit chemotherapie, chirurgie, radiotherapie en uitgebreide behandeling. Hoewel behandeling het recidiefpercentage en het sterftecijfer van patiënten effectief kan verminderen, veroorzaakt langdurige behandeling vaak resistentie tegen meerdere geneesmiddelen, haaruitval op grote oppervlakken, misselijkheid en braken, en ernstige mentale en psychologische belasting 2,3. Met name het potentiële risico op meerdere orgaanmetastasen van borstkanker dwingt mensen ook om nieuwe kruidenbronnen van medicamenteuze therapie te zoeken 4,5.
Fosfoinositide 3-kinase (PI3K)-gemedieerde signalering is betrokken bij de groei, proliferatie en overleving van borstkanker door middel van splicing die de expressie van meerdere genen beïnvloedt6. Als een stroomafwaarts signaalgevoelig eiwit van PI3K, suggereert talrijk bewijs dat eiwitkinase B (AKT) zou kunnen paren met het zoogdierdoelwit van rapamycine (mTOR) -eiwit om borstkanker verder te verhogen 7,8,9. Bovendien wordt beweerd dat de deactivering van PI3K/AKT/mTOR-signalering ook een sleutelcomponent is in geneesmiddelen die kwaadaardige proliferatie remmen en apoptose stimuleren bij borstkanker10,11,12. Het is bekend dat extreme hypoxie in de micro-omgeving van de tumor een enorme toename van hypoxie-induceerbare factor 1-alfa (HIF-1α) veroorzaakt, wat de progressie van borstkanker verder verergert13,14,15. Tegelijkertijd leidt AKT-stimulatie ook tot overmatige accumulatie van HIF-1α, waardoor apoptose in borstkankermonsters wordt beperkt16,17. Interessant is dat is bevestigd dat de activering van PI3K-AKT-HIF-1α-signalering betrokken is bij pathologische progressie en metastase bij verschillende vormen van kanker, waaronder longkanker18, colorectale kanker19, eierstokkanker20 en prostaatkanker21. Naast het feit dat het wordt georkestreerd door HIF-1α, wordt overexpressie van gevorkte hoofdtranscriptiefactor 1 (FoxO1) ook veroorzaakt door AKT-signaleringsstimulatie, die cyclusstilstand en remming van apoptose in borstkankercellen bevordert22,23. Samen suggereert het bovenstaande solide bewijs dat de remming van de cascade van PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering een potentieel nieuw doelwit kan zijn voor medicamenteuze behandeling bij borstkanker.
Van salidroside (Sal) is algemeen aangetoond dat het anti-kanker 24,25, anti-hypoxie26,27,28,29 en immuunversterkende farmacologische activiteiten uitoefent 30. Het is een lichtbruin of bruin poeder dat gemakkelijk oplosbaar is in water, een soort fenylehanoïde glycoside is en een chemische structuurformule heeft van C14H 20 O7 en een molecuulgewicht van300,331,32. Modern farmacologisch onderzoek heeft aangetoond dat Sal de apoptose van maagkankercellen kan bevorderen door PI3K-AKT-mTOR-signalering te beperken24. Verder bewijs suggereert ook dat de onderdrukking van PI3K-AKT-HIF-1α-signalering door Sal-behandeling kan bijdragen aan de apoptose van kankercellen door hun gevoeligheid voor chemotherapeutische middelen te vergroten25. Er zijn ook aanwijzingen dat Sal celmigratie en -invasie beperkt en cyclusstilstand veroorzaakt door apoptose te bevorderen in de MCF-7-cellen van borstkanker bij de mens33,34. Het valt echter nog te bezien of Sal de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering kan reguleren en de kwaadaardige proliferatie van MCF-7-cellen kan remmen. Daarom was dit protocol gericht op het onderzoeken van de effecten van Sal op MCF-7-celmigratie, invasie, celcyclus en apoptose via de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route. De geïntegreerde onderzoeksstrategieën die conventionele, goedkope en onafhankelijke experimenten omvatten, zoals celmigratie- en invasiebeoordelingen, apoptose en celcyclusdetectie door flowcytometrie, reactieve zuurstofspecies (ROS) en Ca2+ fluorescentiebepaling, enz., kunnen een referentie vormen voor het algemene ontwerp van experimenten voor antikankeronderzoek met traditionele kruidengeneeskunde. Het experimentele proces van deze studie is weergegeven in figuur 1.
Borstkanker treft mensen van alle leeftijden en veroorzaakt een onberekenbare fysieke en mentale belasting en grote economische druk1. Borstkanker, met zijn toenemende morbiditeit en mortaliteit elk jaar, heeft ook wereldwijd de aandacht getrokken in termen van het zoeken naar effectieve op kruiden gebaseerde samengestelde therapieën die verder gaan dan conventionele behandelingen 4,5. Veelbelovend is dat een grote hoeveelheid bewijs de a…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Gezondheidscommissie van de provincie Sichuan (120025).
1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
Flow cytometer | BD | FACSCanto | |
Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
Matrigel | Thermo | 356234 | |
mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |