Summary
Her præsenterer vi en protokol til oprettelse af en kassehulrumsdefekt i rotte-lårbensdiafysevæv. Denne model kan vurdere biomaterialers ydeevne under biomekanisk stress og udforske mekanismer for knogleregenerering relateret til intramembranøs osteogenese.
Abstract
Alvorlige knogledefekter eller komplekse brud kan resultere i alvorlige komplikationer såsom manglende forening eller utilstrækkelig knogleheling. Vævsteknik, som involverer anvendelse af celler, stilladser og cytokiner, betragtes som en lovende løsning til knogleregenerering. Derfor spiller forskellige dyremodeller, der simulerer knogledefekter, en afgørende rolle i at udforske det terapeutiske potentiale af vævsteknik til knogleheling. I denne undersøgelse etablerede vi en kasseformet kortikal knogledefektmodel i midten af lårbenet hos rotter, som kunne tjene som en ideel model til at vurdere biomaterialers funktion til at fremme knogleheling. Denne kasseformede kortikale knogledefekt blev boret ved hjælp af et oralt håndstykke med lav hastighed og formet af en drejebænknål. Postoperativ mikro-CT-analyse blev straks udført for at bekræfte den vellykkede etablering af den kortikale knogledefekt i bokshulen. Lårbenene på den opererede side af rotterne blev derefter høstet på flere tidspunkter efter operationen (0 dage, 2 uger, 4 uger og 6 uger). Helingsprocessen af hver prøves defektområde blev evalueret ved hjælp af mikro-CT, hæmatoxylin- og eosinfarvning (H&E) og Masson trikromfarvning. Disse resultater viste et helingsmønster i overensstemmelse med intramembranøs ossifikation, hvor helingen stort set var afsluttet efter 6 uger. Kategoriseringen af denne dyremodels helingsproces giver en effektiv in vivo-metode til at undersøge nye biomaterialer og lægemidler, der er rettet mod intramembranøs ossifikation under heling af knoglevævsdefekter.
Introduction
Brækket og defekt knogle skyldes ofte traumer, tumorer, betændelse og medfødte misdannelser 1,2. Selvom knoglevæv hos unge raske individer typisk besidder robuste regenerative evner3, kan defekter, der overstiger en kritisk størrelse eller helingshindringer på grund af systemiske sygdomme (f.eks. diabetes, osteoporose og infektioner) stadig føre til komplikationer såsom knoglediskontinuitet eller nedsat heling4. For at løse denne kliniske udfordring bruges knogletransplantation eller biomaterialer almindeligvis til at erstatte alvorligt defekt knogle eller til at rekonstruere store knoglesegmenter. Disse behandlinger har dog begrænsninger. For eksempel, selvom det betragtes som guldstandarden, lider autolog knogletransplantation af begrænset donorforsyning og potentielle komplikationer på donorstedet 5,6. Allotransplantater udgør også visse risici, såsom immunmedieret afstødning, potentiel overførsel af sygdomme og negative virkninger på transplantatets biomekaniske og biologiske egenskaber7.
De seneste år har været vidne til en stigning i forskning med fokus på knogledefekthelingsmekanismer. Brugen af alternative biomaterialer og fremskridt inden for vævsteknologi er dukket op som fremtrædende emner inden for knogleregenerering8. Før disse biomaterialer kan anvendes til human terapi, skal de testes in vitro og in vivo for at sikre deres effektivitet og sikkerhed. Den reducerede kompleksitet af in vitro-miljøer og fraværet af immun- og inflammatoriske reaktioner begrænser imidlertid evalueringen af forskellige biomaterialer in vitro. Derfor er det nødvendigt at etablere dyremodeller for forskellige typer knoglevævsdefekter9. Dyremodeller gør det muligt at evaluere biomaterialer under forskellige belastningsforhold, lette forståelsen af artsspecifikke knoglekarakteristika og give indsigt i ligheden mellem dyremodeller og menneskelige kliniske situationer. Disse fordele er afgørende for at studere knogle-stillads-interaktioner og omsætte forskningsresultater til klinisk praksis 9,10.
I øjeblikket bruges mekaniske knogledefekte dyremodeller i vid udstrækning til at validere biomaterialers ydeevne, hvor kranieknogledefektmodeller og segmentelle knogledefektmodeller er de mest almindeligt anvendte metoder11. Segmentelle knogledefektmodeller, der ofte bruges til at efterligne alvorlige lange knogle- eller tibiale traumer, der ender med knoglebrud, er fordelagtige på grund af deres ensartede dimensioner og definerede anatomiske positioner, hvilket forenkler radiologiske eller histologiske evalueringer af ny knogledannelse og revaskularisering. Disse modeller kræver dog metalimplantater for at stabilisere bilaterale fraktursegmenter og nødvendiggør en kompleks helingsproces, der involverer både endokondral og intramembranøs ossifikation12. På den anden side er calvariale knogledefektmodeller blevet et primært screeningsværktøj til evaluering af biomaterialer på grund af deres standardiserede defektdiametre, bekvemme kirurgiske adgang og den understøttende funktion af dura mater og blødt væv13. Selvom de i vid udstrækning anvendes til modellering af intramembranøs knogledannelse i klinisk relevante scenarier, er de uegnede til at evaluere knogleheling under biomekaniske belastningsforhold på grund af deres ikke-bærende karakter under helingsprocessen14.
For at løse disse begrænsninger etablerede vi en boks-hulrum kortikal knogledefektmodel i lårbensdiafysevævet hos rotter. Ved hjælp af mikrocomputertomografi (CT), tredimensionel (3D) rekonstruktion og histopatologisk farvning (Hæmatoxylin, og eosin [HE] og Masson), analyserede vi helingsprocessen af denne model under hæmostaseforhold. Vi sigter mod at tilbyde ny indsigt til evaluering af biomaterialers ydeevne under biomekaniske belastningsforhold og til at studere bioengineering og mekanisme for knogleregenerering i forhold til intramembranøs ossifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg i denne undersøgelse blev gennemgået og godkendt af den etiske komité ved West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-597). Sprague-Dawley-rotter (hanrotter, kropsvægt 300 g) blev brugt til denne undersøgelse.
1. Prækirurgisk forberedelse
- Forberedelse af instrumenter
- Se figur 1A for de kirurgiske instrumenter, der blev brugt i denne undersøgelse: elektrisk barbermaskine, vævssaks, øjensaks, oftalmisk pincet, engangsskalpel, periosteal separator, oralt lavhastighedshåndstykke, oral sonde, engangsvandingsstøvsuger, nåleholder, 3.0 sutur.
- Forbered en oral sonde og marker den store buede ende af sonden med en tusch i henhold til defektens diameter (figur 1B). Brug dette til at bestemme størrelsen af defekten under operationen.
- Steriliser alle kirurgiske materialer og instrumenter, der bruges til at udføre proceduren før brug. Pak de ønskede materialer i foldet klud eller indpakningspapir og forsegl dem med autoklavtape til dampsterilisering (125-135°C i 20-25 min).
- Forberedelse af operationsområdet: Desinficer operationsbordet og miljøet omkring bordet ved at sprøjte med 75 % alkohol. Skab et sterilt område på ca. 60 cm x 90 cm med autoklaverede gardiner på operationsbordet.
- Forberedelse af anæstesi
- Bedøve rotterne intraperitonealt med 10% ketaminhydrochlorid (50-100 mg/kg) og 2% xylazin 2 mg/kg). Brug subkutan injektion af carprofen (5 mg/kg) til præoperativ og intraoperativ analgesi. Undersøg dybden af anæstesi ved tåklemmetest. Efter anæstesi påføres steril øjensalve på øjnene for at forhindre tørre øjne og hornhindeskader.
2. Kirurgisk indgreb
- Placer rotten i en lateral liggende position på det sterile operationsbord og fjern hårene i underekstremiteterne med en elektrisk barbermaskine.
- Brug 5% jodprofopløsning og 75% alkohol til at desinficere hudvævet i operationsområdet.
- Find det proksimale og distale lårben, og lav et snit på 2,5 cm langs lårbenets lange akse for at skære gennem rottens hudvæv.
- Adskil hudlaget fra fascien med oftalmisk pincet og vævssaks, og udsæt den laterale tilgang til lårbenet gennem biceps femoris og laterale lårbensmuskler.
- Find skæringspunktet mellem de to muskelskillevægge (en hvid vævslinje) og adskil forsigtigt med et engangskirurgisk blad langs muskelgrænsen, indtil lårbensoverfladen er nået.
BEMÆRK VENLIGST: Når du bruger et engangsblad til at adskille musklen, er det vigtigt at adskille langs muskelskillevæggen og være forsigtig med at forårsage vaskulær skade i det bløde væv. Begyndere og dem, der ikke er bekendt med anatomien, skal bruge oftalmisk pincet og periosteale separatorer i stump dissektion mellem de to muskelmasser.
- Påfør en periosteal separator for stumt at adskille lårbensoverflademusklerne og blotlægge midten af lårbensdiafysen.
- Brug en steril tusch til at markere området af defektstedet på midten af lårbensdiafysen, placeret øverst på den laterale 1/3 skrå kam af lårbenshovedet.
- Brug det orale lavhastighedshåndstykke med en slowmotion-kugleboremaskine med en diameter på 1.2 mm til at bore et lille hul vinkelret på knogleoverfladen på det markerede sted, og ødelægge periosteum og knoglebarken med en dybde dyb nok til at nå knoglemarvshulen. På dette boredybdeniveau skal du udvide størrelsen på hullet parallelt med denne dybde i alle retninger og trimme for at opnå en kassehulrumsform.
- Brug en mærket oral sonde parallelt med kanten af defekten til at bestemme defektens diameter og morfologi under og efter forberedelse.
- Luk muskel- og hudlagene med henholdsvis 3-0 monofilament absorberbare suturer, og desinficer operationsområdet med 5% jodofor indefra og ud.
3. Postoperativ pleje
- Efter operationen administreres carprofen (5 mg/kg) subkutant og rotten lægges på en varmepude med konstant temperatur, indtil den er kommet sig efter anæstesi. Når rotten genvinder bevidstheden, skal du forsigtigt flytte den til et bur, der indeholder tørt, autoklaveret strøelse.
- Fortsæt analgesi i 24 timer og postoperativ overvågning i 1 uge efter operationen.
4. Prøveudtagning og -analyse
- Aflive rotten menneskeligt efter operationen ved at injicere pentobarbitalnatrium 100-200 mg/kg intraperitonealt. Adskil forsigtigt muskel- og fascievævet på overfladen af lårbenet og fjern lårbenet på den opererede side helt. Saml prøver efter 0 dage (figur 2A, B), 2 uger, 4 uger og 6 uger postoperativt.
- Fastgør lårbensprøverne i 4% paraformaldehyd i 24 timer. Analyser strukturen af femora ved hjælp af mikrocomputertomografi. Indstil scanningsparametrene som følger: Røntgenrørpotentiale, 70 kVp; filter, AL 0,5 mm; Røntgenintensitet, 0,2 mA; voxel størrelse, 17 μm; og integrationstid, 1 × 300 ms. Rekonstruer 3D-modelbilleder ved hjælp af bitmapdata.
- Afkalk prøverne i 10 % EDTA i 8 uger, før de dehydrerer lårbensprøverne i en gradueret serie af ethanolfortyndinger. Læg derefter prøverne i paraffinvoks15.
- Skær de indlejrede prøver i 5 μm paraffinsektioner fra sagittalplanet.
- Farvningssektioner med både et hæmatoxylin- og eosinfarvningssæt (H&E) og et Masson-farvningssæt. Overhold helingen af defektområdet ved histopatologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol etablerer vi med succes en rotte-lårbenskasse-hulrumsdefektmodel med dimensioner på 4,5 mm x 1,5 mm ved boring. For at analysere helingsprocessen indsamlede vi lårbensvævet på den opererede side 0 dage, 2 uger, 4 uger og 6 uger efter operationen, som er de vigtigste tidspunkter for endokondral ossifikation, intramembranøs ossifikation og knogleombygning under helingsprocessen af lårbenstraumer hos rotter2. På postoperativ dag 0 viste rekonstruktion af 3D-modellen fra mikro-CT-bitmapdata, at vi med succes modellerede en bokshulrumsdefekt i lårbenet med en størrelse på 4,5 mm x 1,5 mm dyb til marvhulen (figur 3A). Resultater af mikro-CT viste mineraliseret trabekulær knogledannelse i det interstitielle rum af den kortikale knogledefekt 2 uger efter modeloprettelse (figur 3B). Overfladen af det nye knoglevæv i defektområdet viste moden, tæt kortikal knogle, og trabekulært knoglevæv var stadig synligt på medullærsiden 4 uger postoperativt (figur 3C). Efter 6 uger var defektområdet næsten sammensat af moden, tæt kortikal knogle, med kun en lille mængde trabekulært knoglevæv tilbage nær den medullære side, hvilket indikerer, at defektområdet stort set var helet (figur 3D).
Vi analyserer også de indsamlede prøver ved H&E-farvning og Masson trikrom farvning (figur 4). Resultaterne viste, at naivt trabekulært knoglevæv blev dannet i defektområdet 2 uger postoperativt, og periosteum omkring defektområdet blev fortykket og forbundet med det nyfødte trabekulære knoglevæv i defektområdet (figur 4A,A',B,B'). 4 uger efter skabelsen af defekten blev der dannet tæt kortikaalt knoglevæv på overfladen af defektområdet og forbundet med den kortikale knogle på begge sider af defekten; trabekulært knoglevæv blev resorberet kraftigt på medullærsiden (figur 4C,C',D,D'). Modet kortikalt knoglevæv blev dannet i defektområdet, og det trabekulære knoglevæv på medullærsiden blev næsten fuldstændigt resorberet 6 uger postoperativt (figur 4E,E',F,F'), hvilket indikerer, at defektens helingsproces var næsten afsluttet.
Figur 1: Instrumenter, der er nødvendige for at skabe defekter. (A) Kirurgiske instrumenter. (1) Elektrisk barbermaskine; (2) Oftalmisk pincet; (3) Oftalmisk saks; 4) Engangsskalpel (5) Periosteal separator; (6) Oralt håndstykke med lav hastighed; (7) Modificeret oral sonde; (8) Engangsvandingsstøvsuger; (9) Nåleholder; 10) Vævssakse; (11) 3.0 sutur. (B) Orale sonder mærket med dimensionerne af defektdiameteren. Den store buede ende af den sterile engangssonde blev markeret med en skala på 1,5 mm og 4,5 mm til intraoperativ måling af diameteren af defektområdet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Morfologi af defekten i bokshulrummet (dag 0). (A,B) Måling af prøver fra dag 0 efter operationen ved hjælp af en modificeret oral sonde, der blev brugt til at skabe defekten i bokshulrummet (4,5 mm x 1,2 mm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mikro-CT-analyse af helingsprocessen af defektområdet. 3D rekonstruerede billeder af defektområdet 0 dage, 14 dage, 28 dage og 42 dage efter operationen. (A) Længdeplan . (B-D) Langsgående (venstre panel), sagittale (midterste) og tværsnit (højre panel) mikro-CT-billeder af heling af defektområdet efter 14 dage, 28 dage og 42 dage. Den gule stiplede boks i A, B, C og D repræsenterer defektområdet. Den gule stiplede linje repræsenterer kanterne af defekten, og den gule pil repræsenterer det nye knoglevæv i defektområdet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Histopatologiske resultater. (A-F) H&E og Masson farvning af defektområdet efter 14 dage, 28 dage og 42 dage. (A'-F') De indzoomede billeder af de sorte rektangulære bokse vist i A-F. Trabekulært mineraliseret knoglevæv blev dannet i defektområdet 14 dage efter operationen; kortikalt knoglevæv blev dannet på overfladen af defektområdet og forbundet til begge ender af defektområdet 28 dage efter operationen; Moden kortikal knoglevæv blev dannet i defektområdet 42 dage efter operationen, og helingen var stort set afsluttet. Den blå stiplede linje angiver kanten af defekten; Området omkranset af den røde stiplede linje er det nye knoglevæv i defektområdet. den sorte pil er det fortykkede periosteum; den gule trekant er den gamle kortikale knogle; den grønne pil er det nye trabekulære knoglevæv; de sorte og de gule stjerner er det nye kortikale knoglevæv; og den røde pil er det nye periosteum. Skalabjælker: 500 μm (A-F), 200 μm (A'-F'). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prækliniske dyremodeller er afgørende for at undersøge knogleheling og biomaterialers indflydelse på knogleregenerering. Denne protokol illustrerer en lårbensboks-hulrumsdefektmodel, der replikerer den intramembranøse knogledannelsesproces forbundet med klinisk knogleregenerering. Defektområdet blev intraoperativt standardiseret ved hjælp af en forudmærket oral sonde. Mikro-CT og histopatologiske farvningsresultater viste progressiv heling over 6 uger med fortykket periosteum og ny trabekulær knogledannelse, efterfulgt af tæt kortikal knogledannelse. Der blev ikke observeret bruskvæv under helingsprocessen, hvilket indikerer intramembranøs osteogenese. Dette fund præsenterer nye perspektiver til at studere biomaterialers eller lægemidlers rolle i klinisk knogleregenerering.
Denne protokol kræver omhyggelig opmærksomhed på flere faktorer: (i) Dyb anæstesi er en forudsætning for at forhindre dyrenes nød og sikre nøjagtig defektlokalisering. Anæstesidybde og vitale tegn bør overvåges nøje. (ii) Under muskeladskillelse bør der lægges omhyggelig vægt på at forhindre vaskulær skade, som kan hindre restitution. (iii) Ved forberedelse af defekthullet skal højre omdrejningspunkt holdes stabilt og altid vinkelret på knogleoverfladen for at sikre, at kassedefekten er i samme dybde. Boredybden skal kontrolleres for at fjerne kortikalt knoglevæv uden at gå for dybt. Dette undgår at forsinke knogleheling på grund af overdreven mekanisk ødelæggelse af knoglemarven, hvilket resulterer i fjernelse af mesenkymale stamceller (MSC'er) og forstyrrelse af det inflammatoriske respons16. (iv) Hulromsforberedelsen kræver en assistent til kontinuerligt at skylle området med saltvand for at afbøde potentiel vævsskade forårsaget af varme under knogleablation, samtidig med at det kirurgiske felts synlighed opretholdes.
Knoglebrud, segmentel knogledefekt og kranieknogledefektmodeller er de almindeligt anvendte dyremodeller til at undersøge knogleregenerering. Knoglebrudsmodellen afspejler den faktiske traumeproces, men resultaterne kan variere på grund af forskelle i frakturtværsnit blandtforsøgsdyr 17. Den segmentale knogledefektmodel simulerer effektivt frakturkomplikationer såsom ikke-forening eller forsinket heling. På grund af sin anatomiske placering letter denne model evalueringen af ny knogledannelse og revaskularisering gennem radiografiske eller histologiske metoder18. Denne metode præsenterer dog betydelig variation i defektstørrelse blandt forsøgspersoner; Kravet om skinnefiksering eller intern fiksering med metalimplantater begrænser også dens anvendelse11. Den calvariale defektmodel er kendetegnet ved ingen intern fiksering, høj reproducerbarhed i størrelse og anatomisk position og et stabilt mekanisk miljø14, hvilket også begrænser anvendelsen til evaluering af den biologiske respons på fysiologisk, biomekanisk belastning af implanteret materiale13. I mangel af en transplantatknogle kan invasionen af defekten af dura mater og overliggende blødt væv desuden hindre knogleregenerering, hvilket gør disse modeller følsomme over for stilladsmaterialets ydeevne18. Derfor foreslår denne protokol etableringen af en kassehulrumsdefekt i rotte-lårbensdiafysen, som giver mulighed for intraoperativ måling af defektdiameteren ved hjælp af et simpelt værktøj18. Denne tilgang giver bedre kontrol over defektstandardisering end brud- eller segmentdefektmodellerne og eliminerer behovet for intern eller ekstern fiksering. Desuden er denne model robust over for svækkelse af knogledannelse på grund af bløddelserosion. Denne protokol præsenterer dog visse begrænsninger: (i) Forkert udførelse eller for store defektdiametre kan føre til alvorlig blødning, chok eller endda død hos rotter. For at sikre dyrenes sikkerhed og velfærd er det derfor bydende nødvendigt at øve rottekadavre, før proceduren udføres på levende forsøgspersoner. (ii) Desuden gør fraværet af det Haversian-system i gnaverbarken19 det vanskeligt fuldstændigt at reproducere den naturlige kliniske helingsproces af humant knoglebrud/defekt. Rotter, som gnavere, er omkostningseffektive, kræver minimal vedligeholdelse og er sikre og nemme at håndtere, hvilket giver højere reproducerbarhed end større dyr som kaniner, hunde og geder20.
Sammenfattende udviklede vi en rotte-lårbensdiafyse-boks-hulrumsdefektmodel og sporede helingsprocessen ved hjælp af mikro-CT og histopatologiske farvningsteknikker. Denne protokol giver en omfattende og generaliserbar metode til at undersøge intramembranøs knogledannelse inden for klinisk signifikante knogleregenereringsmodeller. Desuden foreslår den innovative perspektiver for den biologiske ydeevneevaluering af erstatningsbiomaterialer, knogleregenereringsassocierede lægemidler, stilladser osv. Det letter også den prækliniske validering af nye terapeutiske strategier til knoglevævsteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle de originale data og billeder er inkluderet i denne artikel. Forfattere erklærer ingen interessekonflikt
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af tilskud fra National Natural Science Foundation of China 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) og 82100982 (F. L.) og støttet af Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mm slow speed ball drill | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | For preparation of box cavity defects |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suturing wounds |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | For fix the femoral specimens |
| Cotton balls | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | For skin sterilization and cleaning of surgical field |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | For skin disinfection |
| Dental technician grinding machine | Marathon | N3-140232 | For preparation of box cavity defects |
| Disposable scalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue |
| Electric shaver | JASE | BM320210 | Removal of hair tissue from the surgical area |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | For the histological analysis of the specimens |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | For the histological analysis of the specimens |
| Micro CT | Scanco medical ag | µCT 45 | For analyzing the healing of defects in femoral samples |
| Needle holder | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suture-holding needles |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | For analyzing the results of HE staining and Masson staining |
| Ophthalmic forceps | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For clamping skin, muscle tissue |
| Ophthalmic scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
| Oral low-speed handpiece | Marathon | Y221101003 | For preparation of box cavity defects |
| Oral probe | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | For measuring the diameter of defects |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For blunt separation of muscle tissue |
| Sprague–Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | None | For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect |
| Tissue scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
- Holmes, D. Nonunion bone fracture: a quicker fix. Nature. 550 (7677), S193 (2017).
- Dimitriou, R., Jones, E., McGonagle, D., Giannoudis, P. V. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 9, 66 (2011).
- Schmidt, A. H. Autologous bone graft: Is it still the gold standard? Injury. 52 (Suppl 2). , S18-S22 (2021).
- Baldwin, P., et al. Autograft, allograft, and bone graft substitutes: Clinical evidence and indications for use in the setting of orthopaedic trauma surgery. J Orthop Trauma. 33 (4), 203-213 (2019).
- Muscolo, D. L., Ayerza, M. A., Aponte-Tinao, L. A. Massive allograft use in orthopedic oncology. Orthop Clin North Am. 37 (1), 65-74 (2006).
- Yu, Y., et al. Biomimetic periosteum-bone substitute composed of preosteoblast-derived matrix and hydrogel for large segmental bone defect repair. Acta Biomater. 113, 317-327 (2020).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: a review. Eur Cell Mater. 13, 1-10 (2007).
- McGovern, J. A., Griffin, M., Hutmacher, D. W. Animal models for bone tissue engineering and modelling disease. Dis Model Mech. 11 (4), dmm033084 (2018).
- Bigham-Sadegh, A., Oryan, A. Selection of animal models for preclinical strategies in evaluating the fracture healing, bone graft substitutes and bone tissue regeneration and engineering. Connect Tissue Res. 56 (3), 175-194 (2015).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Vajgel, A., et al. A systematic review on the critical size defect model. Clin Oral Implants Res. 25 (8), 879-893 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. A versatile protocol for studying calvarial bone defect healing in a mouse model. Tissue Eng Part C Methods. 23 (11), 686-693 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Sci Adv. 8 (29), eabn4977 (2022).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Bhandari, M., Shaughnessy, S. A minimally invasive percutaneous technique of intramedullary nail insertion in an animal model of fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 121 (10), 591-593 (2001).
- Muschler, G. F., Raut, V. P., Patterson, T. E., Wenke, J. C., Hollinger, J. O. The design and use of animal models for translational research in bone tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Part B Rev. 16 (1), 123-145 (2010).
- Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. Clifford, J., Rosen, M. D. , Wiley-Blackwell, UK. (2019).
- Wong, R. M. Y., et al. A systematic review of current osteoporotic metaphyseal fracture animal models. Bone Joint Res. 7 (1), 6-11 (2018).
