Summary
यहां, हम चूहे ऊरु डायफिसिस ऊतक में बॉक्स-गुहा दोष बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल बायोमेकेनिकल तनाव के तहत बायोमटेरियल प्रदर्शन का आकलन कर सकता है और इंट्रामेम्ब्रानस ओस्टोजेनेसिस से संबंधित हड्डी पुनर्जनन के तंत्र का पता लगा सकता है।
Abstract
गंभीर हड्डी दोष या जटिल फ्रैक्चर के परिणामस्वरूप गंभीर जटिलताएं हो सकती हैं जैसे कि गैर-संघ या अपर्याप्त हड्डी उपचार। ऊतक इंजीनियरिंग, जिसमें कोशिकाओं, मचानों और साइटोकिन्स का अनुप्रयोग शामिल है, को हड्डी पुनर्जनन के लिए एक आशाजनक समाधान माना जाता है। नतीजतन, विभिन्न पशु मॉडल जो हड्डी दोष का अनुकरण करते हैं, हड्डी के उपचार के लिए ऊतक इंजीनियरिंग की चिकित्सीय क्षमता की खोज में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस अध्ययन में, हमने चूहों के मध्य-फीमर में एक बॉक्स के आकार का कॉर्टिकल हड्डी दोष मॉडल स्थापित किया, जो हड्डी के उपचार को बढ़ावा देने में बायोमैटिरियल्स के कार्य का आकलन करने के लिए एक आदर्श मॉडल के रूप में काम कर सकता है। इस बॉक्स के आकार का कॉर्टिकल हड्डी दोष एक मौखिक कम गति वाले हैंडपीस का उपयोग करके ड्रिल किया गया था और एक खराद सुई द्वारा आकार दिया गया था। पोस्ट-ऑपरेटिव माइक्रो-सीटी विश्लेषण तुरंत बॉक्स-गुहा कॉर्टिकल हड्डी दोष की सफल स्थापना की पुष्टि करने के लिए आयोजित किया गया था। चूहों के संचालित पक्ष पर फीमर तो सर्जरी के बाद कई समय बिंदुओं पर काटा गया (0 दिन, 2 सप्ताह, 4 सप्ताह, और 6 सप्ताह). प्रत्येक नमूने के दोष क्षेत्र की उपचार प्रक्रिया का मूल्यांकन माइक्रो-सीटी, हेमटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) धुंधला हो जाना, और मैसन ट्राइक्रोम धुंधला का उपयोग करके किया गया था। इन परिणामों ने इंट्रामेम्ब्रानस ऑसिफिकेशन के अनुरूप एक उपचार पैटर्न का प्रदर्शन किया, जिसमें उपचार अनिवार्य रूप से 6 सप्ताह तक पूरा होता है। इस पशु मॉडल की उपचार प्रक्रिया का वर्गीकरण उपन्यास बायोमैटेरियल्स और दवाओं की जांच के लिए विवो विधि में एक प्रभावी प्रदान करता है जो हड्डी के ऊतकों के दोष उपचार के दौरान इंट्रामेम्ब्रानस ऑसिफिकेशन को लक्षित करता है।
Introduction
खंडित और दोषपूर्ण हड्डी अक्सर आघात, ट्यूमर, सूजन, और जन्मजात विकृतियों 1,2 से परिणाम. हालांकि युवा स्वस्थ व्यक्तियों में हड्डी के ऊतकों में आम तौर पर मजबूत पुनर्योजी क्षमताओं3 के अधिकारी, प्रणालीगत रोगों (जैसे, मधुमेह, ऑस्टियोपोरोसिस, और संक्रमण) के कारण एक महत्वपूर्ण आकार या उपचार बाधाओं से अधिक दोष अभी भी इस तरह के हड्डी discontinuity या बिगड़ाचिकित्सा 4 के रूप में जटिलताओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस नैदानिक चुनौती का समाधान करने के लिए, हड्डी ग्राफ्टिंग या बायोमैटेरियल्स का उपयोग आमतौर पर गंभीर रूप से दोषपूर्ण हड्डी को बदलने या बड़े हड्डी खंडों के पुनर्निर्माण के लिए किया जाता है। हालांकि, इन उपचारों की सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, हालांकि स्वर्ण मानक माना जाता है, ऑटोलॉगस हड्डी ग्राफ्टिंग प्रतिबंधित दाता आपूर्ति और संभावित दाता साइट जटिलताओं 5,6 से ग्रस्त है। एलोग्राफ्ट कुछ जोखिम भी पेश करते हैं, जैसे प्रतिरक्षा-मध्यस्थता अस्वीकृति, रोगों के संभावित संचरण, और भ्रष्टाचार के बायोमेकेनिकल और जैविक गुणों पर नकारात्मक प्रभाव7.
हाल के वर्षों में अस्थि दोष उपचार तंत्र पर ध्यान केंद्रित करने वाले अनुसंधान में वृद्धि देखी गई है। वैकल्पिक बायोमैटेरियल्स का उपयोग और ऊतक इंजीनियरिंग में प्रगति हड्डी पुनर्जनन8 के क्षेत्र में प्रमुख विषयों के रूप में उभरा है। इससे पहले कि इन बायोमैटिरियल्स को मानव चिकित्सा पर लागू किया जा सके, उन्हें उनकी प्रभावकारिता और सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए इन विट्रो और विवो में परीक्षण किया जाना चाहिए। हालांकि, इन विट्रो वातावरण की कम जटिलता और प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की अनुपस्थिति इन विट्रो में विभिन्न बायोमैटेरियल्स के मूल्यांकन को सीमित करती है। नतीजतन, अस्थि ऊतक दोष के विभिन्न प्रकार के लिए पशु मॉडल की स्थापना9 की जरूरत है. पशु मॉडल विभिन्न लोडिंग स्थितियों के तहत बायोमैटिरियल्स के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं, प्रजाति-विशिष्ट हड्डी विशेषताओं की समझ की सुविधा प्रदान करते हैं, और पशु मॉडल और मानव नैदानिक स्थितियों के बीच समानता में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। ये फायदे हड्डी-पाड़ बातचीत का अध्ययन और नैदानिक अभ्यास 9,10 में अनुसंधान निष्कर्षों का अनुवाद करने के लिए आवश्यक हैं.
वर्तमान में, यांत्रिक हड्डी दोष पशु मॉडल व्यापक रूप से कपाल हड्डी दोष मॉडल और खंडीय हड्डी दोष मॉडल सबसे अधिक लागू तरीकों11 जा रहा है के साथ, biomaterials के प्रदर्शन को मान्य करने के लिए उपयोग किया जाता है. खंडीय हड्डी दोष मॉडल, अक्सर हड्डी गैर-संघ में समाप्त होने वाली गंभीर लंबी हड्डी या टिबियल आघात की नकल करने के लिए उपयोग किया जाता है, उनके समान आयामों और परिभाषित शारीरिक पदों के कारण फायदेमंद होते हैं, नई हड्डी के गठन और पुनरोद्धार के रेडियोलॉजिकल या हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन को सरल बनाते हैं। हालांकि, इन मॉडलों को द्विपक्षीय फ्रैक्चर सेगमेंट को स्थिर करने के लिए धातु प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है और एंडोकॉन्ड्रल और इंट्रामेम्ब्रानस ऑसिफिकेशन12 दोनों को शामिल करने वाली एक जटिल उपचार प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, कैल्वरियल अस्थि दोष मॉडल उनके मानकीकृत दोष व्यास, सुविधाजनक सर्जिकल पहुंच और ड्यूरा मेटर और नरम ऊतक13 के सहायक कार्य के कारण बायोमैटिरियल्स के मूल्यांकन के लिए एक प्राथमिक स्क्रीनिंग उपकरण बन गए हैं। यद्यपि वे व्यापक रूप से नैदानिक रूप से प्रासंगिक परिदृश्यों में इंट्रामेम्ब्रानस हड्डी गठन मॉडलिंग के लिए उपयोग किए जाते हैं, वे उपचार प्रक्रिया14 के दौरान उनके गैर-लोड-असर प्रकृति के कारण बायोमेकेनिकल लोडिंग स्थितियों के तहत हड्डी के उपचार के मूल्यांकन के लिए अनुपयुक्त हैं।
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हमने चूहों के ऊरु डायफिसिस ऊतक में एक बॉक्स-गुहा कॉर्टिकल हड्डी दोष मॉडल स्थापित किया। माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) त्रि-आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण, और हिस्टोपैथोलॉजिकल धुंधला (हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन [एचई] और मेसन) का उपयोग करते हुए, हमने हेमोस्टेसिस स्थितियों के तहत इस मॉडल की उपचार प्रक्रिया का विश्लेषण किया। हम बायोमेकेनिकल लोडिंग स्थितियों के तहत बायोमटेरियल प्रदर्शन का मूल्यांकन करने और बायोइंजिनियरिंग और हड्डी पुनर्जनन के तंत्र के साथ-साथ इंट्रामेम्ब्रानस ऑसिफिकेशन का अध्ययन करने के लिए नई अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहते हैं।
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Protocol
इस अध्ययन में सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई और वेस्ट चाइना स्कूल ऑफ स्टोमैटोलॉजी, सिचुआन विश्वविद्यालय (WCHSIRB-D-2021-597) की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। स्प्रैग-डॉली चूहों (पुरुष, शरीर का वजन 300 ग्राम) वर्तमान अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था।
1. प्रीसर्जिकल तैयारी
- उपकरण तैयार करना
- इस अध्ययन में प्रयुक्त शल्य चिकित्सा उपकरणों के लिए चित्रा 1 ए का संदर्भ लें: इलेक्ट्रिक शेवर, ऊतक कैंची, नेत्र कैंची, नेत्र संदंश, डिस्पोजेबल स्केलपेल, पेरीओस्टियल विभाजक, मौखिक कम गति वाले हैंडपीस, मौखिक जांच, डिस्पोजेबल सिंचाई वैक, सुई धारक, 3.0 सिवनी।
- एक मौखिक जांच तैयार करें और दोष के व्यास (चित्रा 1 बी) के अनुसार एक मार्कर पेन के साथ जांच के बड़े घुमावदार अंत को चिह्नित करें। सर्जरी के दौरान दोष के आकार को निर्धारित करने के लिए इसका उपयोग करें।
- उपयोग करने से पहले प्रक्रिया करने के लिए उपयोग की जाने वाली सभी सर्जिकल सामग्री और उपकरणों को स्टरलाइज़ करें। वांछित सामग्री को मुड़े हुए कपड़े या रैपिंग पेपर में पैक करें और उन्हें भाप नसबंदी (20-25 मिनट के लिए 125-135 डिग्री सेल्सियस) के लिए आटोक्लेव टेप से सील करें।
- सर्जिकल क्षेत्र की तैयारी: 75% अल्कोहल के साथ छिड़काव करके ऑपरेटिंग टेबल और टेबल के आसपास के वातावरण को कीटाणुरहित करें। ऑपरेटिंग टेबल पर आटोक्लेव पर्दे के साथ लगभग 60 सेमी x 90 सेमी बाँझ क्षेत्र बनाएं।
- संज्ञाहरण की तैयारी
- चूहों को 10% केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड (50-100 मिलीग्राम/किग्रा) और 2% xylazine 2 मिलीग्राम/किग्रा) के साथ अंतःक्रियात्मक रूप से एनेस्थेटाइज करें। प्रीऑपरेटिव और इंट्राऑपरेटिव एनाल्जेसिया के लिए कारप्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन का उपयोग करें। पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। संज्ञाहरण के बाद, सूखी आंखों और कॉर्नियल चोट को रोकने के लिए आंखों पर बाँझ आंख मरहम लागू करें।
2. सर्जिकल प्रक्रिया
- बाँझ सर्जिकल टेबल पर एक पार्श्व पुनरावृत्ति स्थिति में चूहे प्लेस और एक बिजली शेवर के साथ निचले अंग बाल हटा दें.
- सर्जिकल क्षेत्र में त्वचा के ऊतकों कीटाणुरहित करने के लिए 5% आयोडोफोर समाधान और 75% अल्कोहल का उपयोग करें।
- समीपस्थ और बाहर का फीमर का पता लगाएँ और चूहे की त्वचा के ऊतकों के माध्यम से कटौती करने के लिए फीमर की लंबी धुरी के साथ एक 2.5 सेमी चीरा बनाते हैं.
- नेत्र संदंश और ऊतक कैंची के साथ प्रावरणी से त्वचा की परत को अलग करें, और बाइसेप्स फेमोरिस और पार्श्व ऊरु मांसपेशियों के माध्यम से फीमर के पार्श्व दृष्टिकोण को उजागर करें।
- दो मांसपेशी सेप्टा (एक सफेद ऊतक रेखा) के चौराहे का पता लगाएँ और ध्यान से मांसपेशियों की सीमा के साथ एक डिस्पोजेबल सर्जिकल ब्लेड के साथ अलग जब तक ऊरु सतह तक पहुँच जाता है.
नोट: मांसपेशियों को अलग करने के लिए एक डिस्पोजेबल ब्लेड का उपयोग करते समय, मांसपेशी सेप्टम के साथ अलग करना और नरम ऊतक के भीतर संवहनी चोट पैदा करने से सावधान रहना महत्वपूर्ण है। शुरुआती और शरीर रचना विज्ञान से अपरिचित लोगों को दो मांसपेशियों के थोक के बीच कुंद विच्छेदन में नेत्र संदंश और पेरीओस्टियल विभाजक का उपयोग करना चाहिए।
- ऊरु सतह की मांसपेशियों को कुंद रूप से अलग करने और ऊरु डायफिसिस के बीच को उजागर करने के लिए एक पेरिओस्टियल विभाजक लागू करें।
- ऊरु डायफिसिस की मध्य-सतह पर दोष साइट के क्षेत्र को चिह्नित करने के लिए एक बाँझ मार्कर पेन का उपयोग करें, जो ऊरु सिर के पार्श्व 1/3 तिरछी शिखा के शीर्ष पर स्थित है।
- चिह्नित स्थल पर हड्डी की सतह के लंबवत एक छोटे से छेद ड्रिल करने के लिए एक 1.2 मिमी व्यास धीमी गति गेंद ड्रिल के साथ मौखिक कम गति हैंडपीस का उपयोग करें, अस्थि मज्जा गुहा तक पहुंचने के लिए पर्याप्त गहराई के साथ पेरीओस्टेम और हड्डी प्रांतस्था को नष्ट करें। इस ड्रिलिंग गहराई स्तर पर, सभी दिशाओं में इस गहराई के समानांतर छेद के आकार का विस्तार करें, एक बॉक्स-गुहा आकार प्राप्त करने के लिए ट्रिमिंग करें।
- तैयारी के दौरान और बाद में दोष व्यास और आकृति विज्ञान निर्धारित करने के लिए दोष के किनारे के समानांतर एक लेबल मौखिक जांच का उपयोग करें।
- क्रमशः 3-0 मोनोफिलामेंट शोषक टांके के साथ मांसपेशियों और त्वचा की परतों को बंद करें, और सर्जिकल क्षेत्र को अंदर से बाहर 5% आयोडोफोर के साथ कीटाणुरहित करें।
3. पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल
- सर्जरी के बाद, कारप्रोफेन (5 मिलीग्राम/किग्रा) को चमड़े के नीचे प्रशासित करें और संज्ञाहरण से वसूली तक चूहे को निरंतर तापमान हीटिंग पैड पर रखें। जब चूहा होश में आ जाता है, तो धीरे से उसे एक पिंजरे में ले जाएं जिसमें सूखा, ऑटोक्लेव्ड बिस्तर हो।
- सर्जरी के बाद 1 सप्ताह के लिए 24 घंटे और पोस्ट-ऑपरेटिव निगरानी के लिए एनाल्जेसिया जारी रखें।
4. नमूना संग्रह और विश्लेषण
- पेंटोबार्बिटल सोडियम 100-200 मिलीग्राम/किग्रा इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन लगाकर सर्जरी के बाद चूहे को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दें। फीमर की सतह पर मांसपेशियों और प्रावरणी ऊतक को सावधानीपूर्वक अलग करें और संचालित पक्ष पर फीमर को पूरी तरह से हटा दें। 0 दिनों (चित्रा 2 ए, बी), 2 सप्ताह, 4 सप्ताह, और 6 सप्ताह के बाद के संचालन में नमूने एकत्र करें।
- 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में ऊरु नमूनों को ठीक करें। माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी का उपयोग करके फेमोरा की संरचना का विश्लेषण करें। स्कैनिंग पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: एक्स-रे ट्यूब क्षमता, 70 केवीपी; फिल्टर, एएल 0.5 मिमी; एक्स-रे तीव्रता, 0.2 एमए; वोक्सेल आकार, 17 माइक्रोन; और एकीकरण समय, 1 × 300 एमएस। बिटमैप डेटा का उपयोग करके 3D मॉडल छवियों का पुनर्निर्माण करें।
- इथेनॉल dilutions की एक वर्गीकृत श्रृंखला में ऊरु नमूनों निर्जलीकरण से पहले 8 सप्ताह के लिए 10% EDTA में नमूनों decalcify. फिर, पैराफिन मोम15 में नमूने एम्बेड करें।
- एम्बेडेड नमूनों को धनु विमान से 5 माइक्रोन पैराफिन वर्गों में काटें।
- एक hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला किट और एक मेसन धुंधला किट दोनों के साथ दाग अनुभागों. हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा दोष क्षेत्र के उपचार का निरीक्षण करें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल में, हम ड्रिलिंग द्वारा 4.5 मिमी x 1.5 मिमी के आयामों के साथ एक चूहा ऊरु बॉक्स-गुहा दोष मॉडल सफलतापूर्वक स्थापित करते हैं। उपचार प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए, हमने सर्जरी के बाद 0 दिनों, 2 सप्ताह, 4 सप्ताह और 6 सप्ताह में संचालित पक्ष पर ऊरु ऊतक एकत्र किए, जो चूहों में ऊरु आघात की उपचार प्रक्रिया के दौरान एंडोकॉन्ड्रल ऑसिफिकेशन, इंट्रामेम्ब्रानस ऑसिफिकेशन और हड्डी रीमॉडेलिंग के प्रमुख समय बिंदु हैं2. पोस्ट-ऑपरेटिव दिन 0 पर, माइक्रो-सीटी बिटमैप डेटा से 3 डी मॉडल के पुनर्निर्माण से पता चला है कि हमने मज्जा गुहा(चित्रा 3ए)के लिए 4.5 मिमी x 1.5 मिमी गहरे आकार के साथ फीमर में एक बॉक्स-गुहा दोष को सफलतापूर्वक मॉडल किया है। माइक्रो-सीटी के परिणामों ने मॉडल निर्माण(चित्रा 3बी)के 2 सप्ताह बाद कॉर्टिकल हड्डी दोष के अंतरालीय स्थान में खनिज त्रिकोणीय हड्डी गठन दिखाया। दोष क्षेत्र में नई हड्डी के ऊतकों की सतह ने परिपक्व, घने कॉर्टिकल हड्डी को दिखाया, और ट्रैब्युलर हड्डी ऊतक अभी भी मज्जा पक्ष पर 4 सप्ताह के बाद दिखाई दे रहा था (चित्र 3C)। 6 सप्ताह के बाद, दोष क्षेत्र लगभग परिपक्व, घने कॉर्टिकल हड्डी से बना था, जिसमें मज्जा पक्ष के पास केवल थोड़ी मात्रा में ट्रैब्युलर हड्डी ऊतक शेष था, यह दर्शाता है कि दोष क्षेत्र मूल रूप से ठीक हो गया था (चित्र 3डी)।
हम एच एंड ई धुंधला और मैसन ट्राइक्रोम धुंधला (चित्रा 4) द्वारा एकत्रित नमूनों का भी विश्लेषण करते हैं। परिणामों से पता चला है कि भोले trabecular की तरह हड्डी के ऊतकों दोष क्षेत्र में 2 सप्ताह के बाद का गठन किया गया था, और दोष क्षेत्र के आसपास पेरीओस्टेम मोटा और दोष क्षेत्र में नवजात trabecular हड्डी ऊतक के साथ जुड़ा हुआ है (चित्रा 4A,A',B,B'). दोष पैदा करने के 4 सप्ताह बाद, दोष क्षेत्र की सतह पर घने कॉर्टिकल हड्डी के ऊतकों का गठन किया गया था और दोष के दोनों किनारों पर कॉर्टिकल हड्डी से जुड़ा हुआ था; ट्रैबेक्युलर जैसी हड्डी के ऊतकों को मज्जा पक्ष (चित्रा 4 सी, सी, डी, डी') पर भारी रूप से पुनर्जीवित किया गया था। दोष क्षेत्र में परिपक्व कॉर्टिकल हड्डी ऊतक का गठन किया गया था, और मज्जा पक्ष पर ट्रैब्युलर हड्डी ऊतक लगभग पूरी तरह से 6 सप्ताह के बाद (चित्रा 4ई, ई, एफ, एफ') को पुनर्जीवित किया गया था, यह दर्शाता है कि दोष की उपचार प्रक्रिया लगभग पूरी हो गई थी।
चित्र 1: दोष निर्माण के लिए आवश्यक उपकरण। (ए) सर्जिकल उपकरण। (1) इलेक्ट्रिक शेवर; (2) नेत्र संदंश; (3) नेत्र कैंची; (4) डिस्पोजेबल स्केलपेल; (5) Periosteal विभाजक; (6) मौखिक कम गति वाली हैंडपीस; (7) संशोधित मौखिक जांच; (8) डिस्पोजेबल सिंचाई वैक; (9) सुई धारक; (10) ऊतक कैंची; (11) 3.0 सिवनी। (बी) दोष व्यास के आयामों के साथ लेबल की गई मौखिक जांच। बाँझ डिस्पोजेबल मौखिक जांच के बड़े घुमावदार अंत को दोष क्षेत्र के व्यास के इंट्राऑपरेटिव माप के लिए 1.5 मिमी और 4.5 मिमी पैमाने के साथ चिह्नित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: बॉक्स गुहा दोष (दिन 0) की आकृति विज्ञान। (ए, बी) बॉक्स गुहा दोष (4.5 मिमी x 1.2 मिमी) बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि एक संशोधित मौखिक जांच का उपयोग कर दिन 0 पोस्ट-सर्जरी के नमूनों का मापन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: दोष क्षेत्र की उपचार प्रक्रिया का माइक्रो-सीटी विश्लेषण। सर्जरी के बाद 0 दिनों, 14 दिनों, 28 दिनों और 42 दिनों में दोष क्षेत्र की 3 डी पुनर्निर्मित छवियां। (ए) अनुदैर्ध्य विमान । (बी-डी) अनुदैर्ध्य (बाएं पैनल), धनु (मध्य) और क्रॉस-अनुभागीय (दाएं पैनल) 14 दिनों, 28 दिनों और 42 दिनों में दोष क्षेत्र के उपचार की माइक्रो-सीटी छवियां। A, B, C, और D में पीला धराशायी बॉक्स दोष क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। पीली धराशायी रेखा दोष के किनारों का प्रतिनिधित्व करती है, और पीला तीर दोष क्षेत्र में नई हड्डी के ऊतकों का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4. हिस्टोपैथोलॉजिकल परिणाम। (ए-एफ) एच एंड ई और मैसन 14 दिनों, 28 दिनों और 42 दिनों में दोष क्षेत्र का धुंधला हो जाना। (ए'-एफ') ए-एफ में दिखाए गए काले आयताकार बक्से की ज़ूम-इन छवियां। सर्जरी के 14 दिनों बाद दोष क्षेत्र में ट्रैबेक्युलर जैसी खनिज हड्डी के ऊतकों का गठन किया गया था; कॉर्टिकल हड्डी के ऊतकों का गठन दोष क्षेत्र की सतह पर किया गया था और सर्जरी के बाद 28 दिनों में दोष क्षेत्र के दोनों सिरों से जुड़ा हुआ था; परिपक्व कॉर्टिकल हड्डी ऊतक सर्जरी के 42 दिनों बाद दोष क्षेत्र में बनाया गया था, और उपचार मूल रूप से पूरा हो गया था। नीली बिंदीदार रेखा दोष के किनारे को इंगित करती है; लाल बिंदीदार रेखा से घिरा क्षेत्र दोष क्षेत्र में नई हड्डी ऊतक है; काला तीर गाढ़ा पेरीओस्टेम है; पीला त्रिकोण पुरानी कॉर्टिकल हड्डी है; हरा तीर नया त्रिकोणीय जैसा हड्डी का ऊतक है; काले और पीले तारे नए कॉर्टिकल हड्डी ऊतक हैं; और लाल तीर नया पेरीओस्टेम है। स्केल बार: 500 माइक्रोन (एएफ), 200 माइक्रोन (ए'-एफ')। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल हड्डी के उपचार और हड्डी के पुनर्जनन पर बायोमैटिरियल्स के प्रभाव की जांच के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह प्रोटोकॉल एक ऊरु बॉक्स-गुहा दोष मॉडल को दिखाता है जो नैदानिक हड्डी पुनर्जनन से जुड़ी इंट्रामेम्ब्रानस हड्डी गठन प्रक्रिया की नकल करता है। दोष क्षेत्र को पूर्व-चिह्नित मौखिक जांच का उपयोग करके इंट्राऑपरेटिव रूप से मानकीकृत किया गया था। माइक्रो-सीटी और हिस्टोपैथोलॉजिकल धुंधला परिणामों ने 6 सप्ताह में प्रगतिशील उपचार दिखाया, जिसमें मोटा पेरीओस्टेम और नई ट्रैब्युलर हड्डी का गठन हुआ, इसके बाद घने कॉर्टिकल हड्डी का गठन हुआ। उपचार प्रक्रिया के दौरान कोई उपास्थि ऊतक नहीं देखा गया था, जो इंट्रामेम्ब्रानस ओस्टोजेनेसिस का संकेत देता है। यह खोज नैदानिक हड्डी पुनर्जनन में बायोमैटेरियल्स या दवाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए नए दृष्टिकोण प्रस्तुत करती है।
इस प्रोटोकॉल कई कारकों पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता है: (i) गहरी संज्ञाहरण पशु संकट को रोकने और सटीक दोष स्थानीयकरण सुनिश्चित करने के लिए एक शर्त है। संज्ञाहरण गहराई और महत्वपूर्ण संकेतों की सतर्कता से निगरानी की जानी चाहिए। (ii) मांसपेशियों के अलग होने के दौरान, संवहनी चोट को रोकने के लिए सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए, जो वसूली में बाधा डाल सकता है। (iii) दोष छेद तैयार करने में, दाहिने हाथ के फुलक्रम को स्थिर रखें और हमेशा हड्डी की सतह के लंबवत रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि बॉक्स दोष समान गहराई पर है। अत्यधिक गहराई में जाने के बिना कॉर्टिकल हड्डी के ऊतकों को हटाने के लिए ड्रिल गहराई को नियंत्रित किया जाना चाहिए। यह अस्थि मज्जा के अत्यधिक यांत्रिक विनाश के कारण हड्डी के उपचार में देरी से बचा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) को हटाने और भड़काऊ प्रतिक्रिया16 के विघटन होता है। (iv) कैविटी प्रिपरेशन के लिए एक सहायक की आवश्यकता होती है जो सक्लाइन से क्षेत्र की लगातार सिंचाई करे ताकि शल्य चिकित्सा क्षेत्र की दृश्यता को बनाए रखते हुए अस्थि पृथक्करण के दौरान गर्मी से होने वाली संभावित ऊतक क्षति को कम किया जा सके।
अस्थि फ्रैक्चर, खंडीय हड्डी दोष, और कपाल हड्डी दोष मॉडल हड्डी पुनर्जनन की जांच में आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले पशु मॉडल हैं। हड्डी फ्रैक्चर मॉडल आघात की वास्तविक प्रक्रिया को दर्शाता है, लेकिन परिणाम प्रयोगात्मक जानवरों17 के बीच फ्रैक्चर पार वर्गों में मतभेद के कारण भिन्न हो सकते हैं. खंडीय हड्डी दोष मॉडल प्रभावी रूप से फ्रैक्चर जटिलताओं जैसे कि नॉनयूनियन या विलंबित उपचार का अनुकरण करता है। अपनी शारीरिक स्थिति के कारण, इस मॉडल रेडियोग्राफिक या हिस्टोलॉजिकल तरीकों18 के माध्यम से नई हड्डी गठन और revascularization के मूल्यांकन की सुविधा. हालांकि, यह विधि विषयों के बीच दोष आकार में काफी भिन्नता प्रस्तुत करती है; धातु प्रत्यारोपण के साथ स्प्लिंट निर्धारण या आंतरिक निर्धारण की आवश्यकता भी इसके आवेदन11 को सीमित करती है। कैल्वरियल दोष मॉडल को कोई आंतरिक निर्धारण, आकार और शारीरिक स्थिति में उच्च प्रजनन क्षमता, और एक स्थिर यांत्रिक वातावरण14, जो प्रत्यारोपित सामग्री13 के शारीरिक, बायोमेकेनिकल लोडिंग के लिए जैविक प्रतिक्रिया के मूल्यांकन में आवेदन को प्रतिबंधित करता है, की विशेषता है। इसके अलावा, एक भ्रष्टाचार हड्डी के अभाव में, ड्यूरा मेटर और overlying नरम ऊतक द्वारा दोष के आक्रमण हड्डी पुनर्जनन बाधा कर सकते हैं, इन मॉडलों मचान सामग्री18 के प्रदर्शन के प्रति संवेदनशील बनाने. इसलिए, इस प्रोटोकॉल चूहे ऊरु डायफिसिस, जो एक साधारण उपकरण18 का उपयोग कर दोष व्यास के intraoperative माप के लिए अनुमति देता है में एक बॉक्स गुहा दोष की स्थापना का प्रस्ताव है. यह दृष्टिकोण फ्रैक्चर या खंडीय दोष मॉडल की तुलना में दोष मानकीकरण पर बेहतर नियंत्रण प्रदान करता है और आंतरिक या बाहरी निर्धारण की आवश्यकता को समाप्त करता है। इसके अलावा, यह मॉडल नरम ऊतक क्षरण के कारण हड्डी के गठन की हानि के खिलाफ मजबूत है। यह प्रोटोकॉल, हालांकि, कुछ सीमाएं प्रस्तुत करता है: (i) अनुचित निष्पादन या अत्यधिक दोष व्यास चूहों में गंभीर रक्तस्राव, सदमे, या यहां तक कि घातक भी हो सकता है। इस प्रकार, जानवरों की सुरक्षा और कल्याण सुनिश्चित करने के लिए, जीवित विषयों पर प्रक्रिया करने से पहले चूहे के शवों का अभ्यास करना अनिवार्य है। (ii) इसके अलावा, कृंतक प्रांतस्था19 में हैवेरियन प्रणाली की अनुपस्थिति मानव हड्डी फ्रैक्चर/दोष की प्राकृतिक नैदानिक उपचार प्रक्रिया को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न करना कठिन बना देती है। चूहों, कृन्तकों के रूप में, लागत प्रभावी हैं, कम से कम रखरखाव की आवश्यकता होती है, और सुरक्षित और संभाल करने में आसान कर रहे हैं, इस तरह के खरगोश, कुत्तों, और बकरियों20 के रूप में बड़े जानवरों की तुलना में उच्च प्रजनन क्षमता प्रदान.
सारांश में, हमने एक चूहा ऊरु डायफिसिस बॉक्स-गुहा दोष मॉडल विकसित किया और माइक्रो-सीटी और हिस्टोपैथोलॉजिक धुंधला तकनीकों का उपयोग करके उपचार प्रक्रिया को ट्रैक किया। यह प्रोटोकॉल नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण हड्डी पुनर्जनन मॉडल के भीतर इंट्रामेम्ब्रानस हड्डी गठन की जांच के लिए एक व्यापक और सामान्यीकरण विधि प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, यह स्थानापन्न बायोमैटेरियल्स, हड्डी पुनर्जनन से जुड़ी दवाओं, मचानों आदि के जैविक प्रदर्शन मूल्यांकन के लिए अभिनव दृष्टिकोण का प्रस्ताव करता है। यह हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग के लिए आकस्मिक चिकित्सीय रणनीतियों के प्रीक्लिनिकल सत्यापन की सुविधा भी प्रदान करता है।
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Disclosures
सभी मूल डेटा और चित्र इस पेपर में शामिल हैं। लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं
Acknowledgments
इस अध्ययन को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना 82101000 (एचडब्ल्यू), U21A20368 (एलवाई), और 82100982 (एफएल) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और सिचुआन विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम 2023NSFSC1499 (एचडब्ल्यू) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mm slow speed ball drill | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | For preparation of box cavity defects |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suturing wounds |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | For fix the femoral specimens |
| Cotton balls | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | For skin sterilization and cleaning of surgical field |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | For skin disinfection |
| Dental technician grinding machine | Marathon | N3-140232 | For preparation of box cavity defects |
| Disposable scalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue |
| Electric shaver | JASE | BM320210 | Removal of hair tissue from the surgical area |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | For the histological analysis of the specimens |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | For the histological analysis of the specimens |
| Micro CT | Scanco medical ag | µCT 45 | For analyzing the healing of defects in femoral samples |
| Needle holder | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suture-holding needles |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | For analyzing the results of HE staining and Masson staining |
| Ophthalmic forceps | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For clamping skin, muscle tissue |
| Ophthalmic scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
| Oral low-speed handpiece | Marathon | Y221101003 | For preparation of box cavity defects |
| Oral probe | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | For measuring the diameter of defects |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For blunt separation of muscle tissue |
| Sprague–Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | None | For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect |
| Tissue scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
- Holmes, D. Nonunion bone fracture: a quicker fix. Nature. 550 (7677), S193 (2017).
- Dimitriou, R., Jones, E., McGonagle, D., Giannoudis, P. V. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 9, 66 (2011).
- Schmidt, A. H. Autologous bone graft: Is it still the gold standard? Injury. 52 (Suppl 2). , S18-S22 (2021).
- Baldwin, P., et al. Autograft, allograft, and bone graft substitutes: Clinical evidence and indications for use in the setting of orthopaedic trauma surgery. J Orthop Trauma. 33 (4), 203-213 (2019).
- Muscolo, D. L., Ayerza, M. A., Aponte-Tinao, L. A. Massive allograft use in orthopedic oncology. Orthop Clin North Am. 37 (1), 65-74 (2006).
- Yu, Y., et al. Biomimetic periosteum-bone substitute composed of preosteoblast-derived matrix and hydrogel for large segmental bone defect repair. Acta Biomater. 113, 317-327 (2020).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: a review. Eur Cell Mater. 13, 1-10 (2007).
- McGovern, J. A., Griffin, M., Hutmacher, D. W. Animal models for bone tissue engineering and modelling disease. Dis Model Mech. 11 (4), dmm033084 (2018).
- Bigham-Sadegh, A., Oryan, A. Selection of animal models for preclinical strategies in evaluating the fracture healing, bone graft substitutes and bone tissue regeneration and engineering. Connect Tissue Res. 56 (3), 175-194 (2015).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Vajgel, A., et al. A systematic review on the critical size defect model. Clin Oral Implants Res. 25 (8), 879-893 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. A versatile protocol for studying calvarial bone defect healing in a mouse model. Tissue Eng Part C Methods. 23 (11), 686-693 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Sci Adv. 8 (29), eabn4977 (2022).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Bhandari, M., Shaughnessy, S. A minimally invasive percutaneous technique of intramedullary nail insertion in an animal model of fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 121 (10), 591-593 (2001).
- Muschler, G. F., Raut, V. P., Patterson, T. E., Wenke, J. C., Hollinger, J. O. The design and use of animal models for translational research in bone tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Part B Rev. 16 (1), 123-145 (2010).
- Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. Clifford, J., Rosen, M. D. , Wiley-Blackwell, UK. (2019).
- Wong, R. M. Y., et al. A systematic review of current osteoporotic metaphyseal fracture animal models. Bone Joint Res. 7 (1), 6-11 (2018).
