Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di un difetto di cavità scatolare nel tessuto della diafisi femorale di ratto. Questo modello è in grado di valutare le prestazioni dei biomateriali in condizioni di stress biomeccanico ed esplorare i meccanismi di rigenerazione ossea correlati all'osteogenesi intramembranosa.
Abstract
Gravi difetti ossei o fratture complesse possono causare gravi complicazioni come la mancata unione o una guarigione ossea insufficiente. L'ingegneria tissutale, che prevede l'applicazione di cellule, scaffold e citochine, è considerata una soluzione promettente per la rigenerazione ossea. Di conseguenza, vari modelli animali che simulano i difetti ossei svolgono un ruolo cruciale nell'esplorazione del potenziale terapeutico dell'ingegneria tissutale per la guarigione ossea. In questo studio, abbiamo stabilito un modello di difetto osseo corticale a forma di scatola nel femore medio dei ratti, che potrebbe servire come modello ideale per valutare la funzione dei biomateriali nel promuovere la guarigione ossea. Questo difetto osseo corticale a forma di scatola è stato perforato utilizzando un manipolo orale a bassa velocità e modellato da un ago da tornio. L'analisi micro-TC post-operatoria è stata immediatamente condotta per confermare il successo dell'instaurazione del difetto osseo corticale della cavità scatolare. I femori sul lato operato dei ratti sono stati quindi raccolti in più punti temporali dopo l'intervento chirurgico (0 giorni, 2 settimane, 4 settimane e 6 settimane). Il processo di guarigione dell'area difettosa di ciascun campione è stato valutato utilizzando la micro-CT, la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e la colorazione tricromica di Masson. Questi risultati hanno dimostrato un modello di guarigione coerente con l'ossificazione intramembranosa, con una guarigione sostanzialmente completa entro 6 settimane. La categorizzazione del processo di guarigione di questo modello animale fornisce un metodo efficace in vivo per lo studio di nuovi biomateriali e farmaci che mirano all'ossificazione intramembranosa durante la guarigione dei difetti del tessuto osseo.
Introduction
L'osso fratturato e difettoso spesso deriva da traumi, tumori, infiammazioni e malformazioni congenite 1,2. Sebbene il tessuto osseo nei giovani individui sani possieda tipicamente robuste capacità rigenerative3, difetti che superano una dimensione critica o impedimenti di guarigione dovuti a malattie sistemiche (ad esempio, diabete, osteoporosi e infezioni) possono ancora portare a complicanze come discontinuità ossea o alterata guarigione4. Per affrontare questa sfida clinica, l'innesto osseo o i biomateriali sono comunemente usati per sostituire l'osso gravemente difettoso o per ricostruire grandi segmenti ossei. Tuttavia, questi trattamenti hanno dei limiti. Ad esempio, sebbene sia considerato il gold standard, l'innesto osseo autologo soffre di una fornitura limitata di donatori e di potenziali complicanze del sito donatore 5,6. Gli allotrapianti presentano anche alcuni rischi, come il rigetto immuno-mediato, la potenziale trasmissione di malattie e gli impatti negativi sulle proprietà biomeccaniche e biologiche del trapianto7.
Negli ultimi anni si è assistito a un'impennata della ricerca incentrata sui meccanismi di guarigione dei difetti ossei. L'uso di biomateriali alternativi e i progressi nell'ingegneria tissutale sono emersi come argomenti di primo piano nel campo della rigenerazione ossea8. Prima che questi biomateriali possano essere applicati alla terapia umana, devono essere testati in vitro e in vivo per garantirne l'efficacia e la sicurezza. Tuttavia, la ridotta complessità degli ambienti in vitro e l'assenza di risposte immunitarie e infiammatorie limitano la valutazione di vari biomateriali in vitro. Di conseguenza, è necessaria la creazione di modelli animali per vari tipi di difetti del tessuto osseo9. I modelli animali consentono la valutazione dei biomateriali in diverse condizioni di carico, facilitano la comprensione delle caratteristiche ossee specie-specifiche e forniscono informazioni sulla somiglianza tra i modelli animali e le situazioni cliniche umane. Questi vantaggi sono essenziali per studiare le interazioni tra impalcatura ossea e tradurre i risultati della ricerca nella pratica clinica 9,10.
Attualmente, i modelli animali di difetti ossei meccanici sono ampiamente utilizzati per convalidare le prestazioni dei biomateriali, con i modelli di difetti ossei cranici e i modelli di difetti ossei segmentali che sono i metodi più comunemente applicati11. I modelli di difetto osseo segmentale, spesso utilizzati per imitare gravi traumi ossei lunghi o tibiali che terminano con la mancata unione ossea, sono vantaggiosi grazie alle loro dimensioni uniformi e alle posizioni anatomiche definite, semplificando le valutazioni radiologiche o istologiche della formazione di nuovo osso e della rivascolarizzazione. Tuttavia, questi modelli richiedono impianti metallici per stabilizzare i segmenti di frattura bilaterale e richiedono un complesso processo di guarigione che coinvolge sia l'ossificazione endocondrale che quella intramembranosa12. D'altra parte, i modelli di difetti ossei calvari sono diventati uno strumento di screening primario per la valutazione dei biomateriali grazie ai loro diametri standardizzati dei difetti, al comodo accesso chirurgico e alla funzione di supporto della dura madre e dei tessuti molli13. Sebbene siano ampiamente utilizzati per modellare la formazione di osso intramembranoso in scenari clinicamente rilevanti, non sono adatti per valutare la guarigione ossea in condizioni di carico biomeccanico a causa della loro natura non portante durante il processo di guarigione14.
Per affrontare queste limitazioni, abbiamo stabilito un modello di difetto osseo corticale a cavità scatolare nel tessuto della diafisi femorale dei ratti. Utilizzando la micro-tomografia computerizzata (TC), la ricostruzione tridimensionale (3D) e la colorazione istopatologica (ematossilina ed eosina [HE] e Masson), abbiamo analizzato il processo di guarigione di questo modello in condizioni di emostasi. Il nostro obiettivo è quello di offrire nuove intuizioni per valutare le prestazioni dei biomateriali in condizioni di carico biomeccanico e per studiare la bioingegneria e il meccanismo della rigenerazione ossea rispetto all'ossificazione intramembranosa.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato etico della West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-597). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (maschio, peso corporeo 300 g).
1. Preparazione prechirurgica
- Preparazione dello strumento
- Fare riferimento alla Figura 1A per gli strumenti chirurgici utilizzati in questo studio: rasoio elettrico, forbici per tessuti, forbici oftalmiche, pinze oftalmiche, bisturi monouso, separatore periostale, manipolo orale a bassa velocità, sonda orale, aspiratore per irrigazione monouso, porta aghi, sutura 3.0.
- Preparare una sonda orale e contrassegnare l'estremità curva grande della sonda con un pennarello in base al diametro del difetto (Figura 1B). Utilizzare questo per determinare la dimensione del difetto durante l'intervento chirurgico.
- Sterilizzare tutti i materiali chirurgici e gli strumenti utilizzati per eseguire la procedura prima dell'uso. Imballare i materiali desiderati in un panno piegato o in carta da imballaggio e sigillarli con nastro adesivo per autoclave per sterilizzazione a vapore (125-135°C per 20-25 min).
- Preparazione dell'area chirurgica: disinfettare il tavolo operatorio e l'ambiente intorno al tavolo spruzzando con alcol al 75%. Creare un'area sterile di circa 60 cm x 90 cm con teli autoclavati sul tavolo operatorio.
- Preparazione all'anestesia
- Anestetizzare i ratti per via intraperitoneale con ketamina cloridrato al 10% (50-100 mg/kg) e xilazina al 2% 2 mg/kg). Utilizzare l'iniezione sottocutanea di carprofene (5 mg/kg) per l'analgesia preoperatoria e intraoperatoria. Esaminare la profondità dell'anestesia mediante il test di pizzicamento delle dita dei piedi. Dopo l'anestesia, applicare un unguento sterile sugli occhi per prevenire secchezza oculare e lesioni corneali.
2. Procedura chirurgica
- Posizionare il ratto in posizione decubita laterale sul tavolo chirurgico sterile e rimuovere i peli degli arti inferiori con un rasoio elettrico.
- Utilizzare una soluzione di iodoforo al 5% e alcol al 75% per disinfettare il tessuto cutaneo nell'area chirurgica.
- Localizzare il femore prossimale e distale e praticare un'incisione di 2,5 cm lungo l'asse lungo del femore per tagliare il tessuto cutaneo del ratto.
- Separare lo strato cutaneo dalla fascia con una pinza oftalmica e forbici per tessuti ed esporre l'approccio laterale al femore attraverso il bicipite femorale e i muscoli femorali laterali.
- Individuare l'intersezione dei due setti muscolari (una linea di tessuto bianco) e separare con cura con una lama chirurgica monouso lungo il bordo muscolare fino a raggiungere la superficie femorale.
NOTA: Quando si utilizza una lama usa e getta per separare il muscolo, è importante separare lungo il setto muscolare e fare attenzione a non causare lesioni vascolari all'interno dei tessuti molli. I principianti e coloro che non hanno familiarità con l'anatomia devono utilizzare pinze oftalmiche e separatori periostali nella dissezione smussata tra le due masse muscolari.
- Applicare un separatore periostale per separare bruscamente i muscoli della superficie femorale ed esporre il centro della diafisi femorale.
- Utilizzare un pennarello sterile per contrassegnare l'area del sito del difetto sulla superficie mediana della diafisi femorale, situata nella parte superiore della cresta obliqua laterale di 1/3 della testa del femore.
- Utilizzare il manipolo orale a bassa velocità con un trapano a sfera al rallentatore di 1,2 mm di diametro per praticare un piccolo foro perpendicolare alla superficie ossea nel sito contrassegnato, distruggendo il periostio e la corteccia ossea con una profondità sufficiente a raggiungere la cavità del midollo osseo. A questo livello di profondità di foratura, espandere la dimensione del foro parallelamente a questa profondità in tutte le direzioni, tagliando per ottenere una forma a cavità scatolata.
- Utilizzare una sonda orale marcata parallela al bordo del difetto per determinare il diametro e la morfologia del difetto durante e dopo la preparazione.
- Chiudere gli strati muscolari e cutanei con suture riassorbibili in monofilamento 3-0, rispettivamente, e disinfettare l'area chirurgica con iodoforo al 5% dall'interno verso l'esterno.
3. Assistenza post-operatoria
- Dopo l'intervento chirurgico, somministrare carprofene (5 mg/kg) per via sottocutanea e mettere il ratto su un termoforo a temperatura costante fino al recupero dall'anestesia. Quando il ratto riprende conoscenza, spostalo delicatamente in una gabbia che contiene lettiera asciutta e autoclavata.
- Continuare l'analgesia per 24 ore e il monitoraggio post-operatorio per 1 settimana dopo l'intervento.
4. Raccolta e analisi dei campioni
- Sopprimere umanamente il ratto dopo l'intervento chirurgico iniettando pentobarbital sodico 100-200 mg/kg per via intraperitoneale. Separare con cura il tessuto muscolare e fasciale sulla superficie del femore e rimuovere completamente il femore sul lato operato. Raccogliere i campioni a 0 giorni (Figura 2A, B), 2 settimane, 4 settimane e 6 settimane dopo l'intervento.
- Fissare i campioni femorali in paraformaldeide al 4% per 24 ore. Analizzare la struttura del femore utilizzando la micro-tomografia computerizzata. Impostare i parametri di scansione come segue: potenziale del tubo a raggi X, 70 kVp; filtro, AL 0,5 mm; Intensità dei raggi X, 0,2 mA; dimensione del voxel, 17 μm; e tempo di integrazione, da 1 × 300 ms. Ricostruisci le immagini del modello 3D utilizzando dati bitmap.
- Decalcificare i campioni in EDTA al 10% per 8 settimane prima di disidratare i campioni femorali in una serie graduale di diluizioni di etanolo. Quindi, incorporare i campioni nella cera di paraffina15.
- Tagliare i campioni incorporati in sezioni di paraffina da 5 μm dal piano sagittale.
- Colora le sezioni con un kit di colorazione ematossilina ed eosina (H&E) e un kit di colorazione Masson. Osservare la guarigione dell'area difettosa mediante istopatologia.
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Representative Results
In questo protocollo, abbiamo stabilito con successo un modello di difetto della cavità della scatola femorale di ratto con dimensioni di 4,5 mm x 1,5 mm mediante perforazione. Al fine di analizzare il processo di guarigione, abbiamo raccolto il tessuto femorale sul lato operato a 0 giorni, 2 settimane, 4 settimane e 6 settimane dopo l'intervento chirurgico, che sono i punti temporali chiave dell'ossificazione endocondrale, dell'ossificazione intramembranosa e del rimodellamento osseo durante il processo di guarigione del trauma femorale nei ratti2. Il giorno 0 post-operatorio, la ricostruzione del modello 3D a partire dai dati bitmap micro-CT ha mostrato che abbiamo modellato con successo un difetto della cavità scatolare nel femore con una dimensione di 4,5 mm x 1,5 mm di profondità fino alla cavità midollare (Figura 3A). I risultati della micro-TC hanno mostrato la formazione di osso trabecolare mineralizzato nello spazio interstiziale del difetto osseo corticale 2 settimane dopo la creazione del modello (Figura 3B). La superficie del nuovo tessuto osseo nell'area del difetto mostrava un osso corticale maturo e denso, e il tessuto osseo trabecolare era ancora visibile sul lato midollare 4 settimane dopo l'intervento (Figura 3C). Dopo 6 settimane, l'area del difetto era quasi composta da osso corticale maturo e denso, con solo una piccola quantità di tessuto osseo trabecolare rimasto vicino al lato midollare, indicando che l'area del difetto era sostanzialmente guarita (Figura 3D).
Analizziamo anche i campioni raccolti mediante colorazione H&E e colorazione tricromica di Masson (Figura 4). I risultati hanno mostrato che il tessuto osseo naïve simile a quello trabecolare si è formato nell'area del difetto 2 settimane dopo l'intervento e il periostio attorno all'area del difetto si è ispessito e collegato con il tessuto osseo trabecolare neonato nell'area del difetto (Figura 4A, A', B, B'). A 4 settimane dalla creazione del difetto, si è formato un denso tessuto osseo corticale sulla superficie dell'area del difetto e si è collegato con l'osso corticale su entrambi i lati del difetto; il tessuto osseo di tipo trabecolare è stato riassorbito pesantemente sul lato midollare (Figura 4C,C',D,D'). Il tessuto osseo corticale maturo si è formato nell'area del difetto e il tessuto osseo trabecolare sul lato midollare è stato quasi completamente riassorbito 6 settimane dopo l'intervento (Figura 4E, E', F, F'), indicando che il processo di guarigione del difetto era quasi completo.
Figura 1: Strumenti necessari per la creazione del difetto . (A) Strumenti chirurgici. (1) Rasoio elettrico; (2) Pinze oftalmiche; (3) Forbici oftalmiche; (4) bisturi usa e getta; (5) Separatore periostale; (6) Manipolo orale a bassa velocità; (7) Sonda orale modificata; (8) Aspiratore di irrigazione usa e getta; (9) Porta aghi; (10) Forbici per tessuti; (11) Sutura 3.0. (B) Sonde orali etichettate con le dimensioni del diametro del difetto. La grande estremità curva della sonda orale sterile monouso è stata contrassegnata con una scala da 1,5 mm e 4,5 mm per la misurazione intraoperatoria del diametro dell'area difettosa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Morfologia del difetto della cavità scatolare (Giorno 0). (A,B) Misurazione dei campioni post-operatorio del Giorno 0 utilizzando una sonda orale modificata che è stata utilizzata per creare il difetto della cavità scatolare (4,5 mm x 1,2 mm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi micro-CT del processo di guarigione dell'area difettosa. Immagini ricostruite in 3D dell'area difettosa a 0 giorni, 14 giorni, 28 giorni e 42 giorni dopo l'intervento chirurgico. (A) Piano longitudinale . (B-D) Immagini micro-TC longitudinali (pannello sinistro), sagittali (al centro) e trasversali (pannello destro) della guarigione dell'area difettosa a 14 giorni, 28 giorni e 42 giorni. La casella tratteggiata gialla in A, B, C e D rappresenta l'area del difetto. La linea tratteggiata gialla rappresenta i bordi del difetto e la freccia gialla rappresenta il nuovo tessuto osseo nell'area del difetto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Risultati istopatologici. (A-F) Colorazione H&E e Masson dell'area difettosa a 14 giorni, 28 giorni e 42 giorni. (A'-F') Le immagini ingrandite dei riquadri rettangolari neri mostrate in A-F. Il tessuto osseo mineralizzato di tipo trabecolare si è formato nell'area del difetto a 14 giorni dall'intervento chirurgico; il tessuto osseo corticale si è formato sulla superficie dell'area del difetto e si è collegato a entrambe le estremità dell'area del difetto a 28 giorni dopo l'intervento chirurgico; Il tessuto osseo corticale maturo si è formato nell'area del difetto a 42 giorni dall'intervento chirurgico e la guarigione è stata sostanzialmente completata. La linea tratteggiata blu indica il bordo del difetto; l'area cerchiata dalla linea tratteggiata rossa è il nuovo tessuto osseo nell'area del difetto; la freccia nera è il periostio ispessito; il triangolo giallo è il vecchio osso corticale; La freccia verde è il nuovo tessuto osseo trabecolare; le stelle nere e gialle sono il nuovo tessuto osseo corticale; e la freccia rossa è il nuovo periostio. Barre di scala: 500 μm (A-F), 200 μm (A'-F'). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I modelli animali preclinici sono fondamentali per esaminare la guarigione ossea e l'influenza dei biomateriali sulla rigenerazione ossea. Questo protocollo illustra un modello di difetto della cavità scatolare femorale che replica il processo di formazione dell'osso intramembranoso associato alla rigenerazione ossea clinica. L'area del difetto è stata standardizzata intraoperatoriamente utilizzando una sonda orale premarcata. I risultati della micro-TC e della colorazione istopatologica hanno mostrato una guarigione progressiva nell'arco di 6 settimane, con periostio ispessito e nuova formazione di osso trabecolare, seguiti da formazione di osso corticale denso. Durante il processo di guarigione non è stato osservato tessuto cartilagineo, indicando un'osteogenesi intramembranosa. Questa scoperta presenta nuove prospettive per lo studio del ruolo dei biomateriali o dei farmaci nella rigenerazione ossea clinica.
Questo protocollo richiede un'attenta attenzione a diversi fattori: (i) L'anestesia profonda è un prerequisito per prevenire il disagio degli animali e garantire un'accurata localizzazione dei difetti. La profondità dell'anestesia e i segni vitali devono essere monitorati con attenzione. (ii) Durante la separazione muscolare, è necessario prestare meticolosa attenzione per prevenire lesioni vascolari, che potrebbero ostacolare il recupero. (iii) Nella preparazione del foro del difetto, mantenere il fulcro destro stabile e sempre perpendicolare alla superficie ossea per garantire che il difetto della scatola sia alla stessa profondità. La profondità della fresa deve essere controllata per rimuovere il tessuto osseo corticale senza andare eccessivamente in profondità. Ciò evita di ritardare la guarigione ossea a causa dell'eccessiva distruzione meccanica del midollo osseo, con conseguente rimozione delle cellule staminali mesenchimali (MSC) e interruzione della risposta infiammatoria16. (iv) La preparazione della cavità richiede un assistente per irrigare continuamente l'area con soluzione salina per mitigare i potenziali danni ai tessuti causati dal calore durante l'ablazione ossea, mantenendo la visibilità del campo chirurgico.
I modelli di frattura ossea, difetto osseo segmentale e difetto osseo cranico sono i modelli animali comunemente usati nello studio della rigenerazione ossea. Il modello di frattura ossea riflette l'effettivo processo del trauma, ma i risultati possono variare a causa delle differenze nelle sezioni trasversali delle fratture tra gli animali da esperimento17. Il modello di difetto osseo segmentale simula efficacemente le complicanze della frattura come la mancata unione o la guarigione ritardata. Grazie al suo posizionamento anatomico, questo modello facilita la valutazione della formazione di nuovo osso e la rivascolarizzazione attraverso metodi radiografici o istologici18. Tuttavia, questo metodo presenta una notevole variazione nella dimensione del difetto tra i soggetti; Anche il requisito della fissazione della stecca o della fissazione interna con impianti metallici ne limita l'applicazione11. Il modello di difetto calvariale è caratterizzato dall'assenza di fissazione interna, dall'elevata riproducibilità delle dimensioni e della posizione anatomica e da un ambiente meccanico stabile14, che limita anche l'applicazione nella valutazione della risposta biologica al carico fisiologico e biomeccanico del materiale impiantato13. Inoltre, in assenza di un osso da innesto, l'invasione del difetto da parte della dura madre e dei tessuti molli sovrastanti può ostacolare la rigenerazione ossea, rendendo questi modelli sensibili alle prestazioni del materiale dell'impalcatura18. Pertanto, questo protocollo propone la creazione di un difetto di cavità scatolare nella diafisi femorale di ratto, che consente la misurazione intraoperatoria del diametro del difetto utilizzando un semplice strumento18. Questo approccio offre un migliore controllo sulla standardizzazione dei difetti rispetto ai modelli con frattura o difetto segmentale ed elimina la necessità di fissazione interna o esterna. Inoltre, questo modello è robusto contro la compromissione della formazione ossea dovuta all'erosione dei tessuti molli. Questo protocollo, tuttavia, presenta alcune limitazioni: (i) Un'esecuzione impropria o diametri difettosi eccessivi possono portare a gravi emorragie, shock o addirittura alla morte nei ratti. Pertanto, per garantire la sicurezza e il benessere degli animali, è imperativo esercitarsi con cadaveri di ratto prima di eseguire la procedura su soggetti vivi. (ii) Inoltre, l'assenza del sistema Haversiano nella corteccia dei roditori19 rende difficile riprodurre completamente il naturale processo di guarigione clinica della frattura/difetto osseo umano. I ratti, come i roditori, sono economici, richiedono una manutenzione minima e sono sicuri e facili da maneggiare, fornendo una maggiore riproducibilità rispetto ad animali più grandi come conigli, cani e capre20.
In sintesi, abbiamo sviluppato un modello di difetto della cavità della diafisi femorale del ratto e monitorato il processo di guarigione utilizzando tecniche di micro-TC e colorazione istopatologica. Questo protocollo fornisce un metodo completo e generalizzabile per esaminare la formazione ossea intramembranosa all'interno di modelli di rigenerazione ossea clinicamente significativi. Inoltre, propone prospettive innovative per la valutazione delle prestazioni biologiche di biomateriali sostitutivi, farmaci associati alla rigenerazione ossea, scaffold, ecc. Facilita inoltre la convalida preclinica di strategie terapeutiche emergenti per l'ingegneria del tessuto osseo.
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Disclosures
Tutti i dati e le immagini originali sono inclusi in questo documento. Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) e 82100982 (F. L.) e supportato dal Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mm slow speed ball drill | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | For preparation of box cavity defects |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suturing wounds |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | For fix the femoral specimens |
| Cotton balls | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | For skin sterilization and cleaning of surgical field |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | For skin disinfection |
| Dental technician grinding machine | Marathon | N3-140232 | For preparation of box cavity defects |
| Disposable scalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue |
| Electric shaver | JASE | BM320210 | Removal of hair tissue from the surgical area |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | For the histological analysis of the specimens |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | For the histological analysis of the specimens |
| Micro CT | Scanco medical ag | µCT 45 | For analyzing the healing of defects in femoral samples |
| Needle holder | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suture-holding needles |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | For analyzing the results of HE staining and Masson staining |
| Ophthalmic forceps | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For clamping skin, muscle tissue |
| Ophthalmic scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
| Oral low-speed handpiece | Marathon | Y221101003 | For preparation of box cavity defects |
| Oral probe | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | For measuring the diameter of defects |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For blunt separation of muscle tissue |
| Sprague–Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | None | For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect |
| Tissue scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
References
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