Summary
Her presenterer vi en protokoll for å lage en bokshulromsdefekt i rotte-lårbensdiafysevev. Denne modellen kan vurdere biomaterialytelse under biomekanisk stress og utforske mekanismer for beinregenerering relatert til intramembranøs osteogenese.
Abstract
Alvorlige beindefekter eller komplekse brudd kan føre til alvorlige komplikasjoner som ikke-forening eller utilstrekkelig beinheling. Vevsteknikk, som involverer påføring av celler, stillaser og cytokiner, regnes som en lovende løsning for beinregenerering. Følgelig spiller ulike dyremodeller som simulerer beindefekter en avgjørende rolle i å utforske det terapeutiske potensialet til vevsteknikk for beinheling. I denne studien etablerte vi en boksformet kortikal beindefektmodell i midten av lårbenet til rotter, som kan tjene som en ideell modell for å vurdere funksjonen til biomaterialer for å fremme beinheling. Denne boksformede kortikale beindefekten ble boret ved hjelp av et oralt lavhastighetshåndstykke og formet av en dreiebenknål. Postoperativ mikro-CT-analyse ble umiddelbart utført for å bekrefte vellykket etablering av boks-hulens kortikale beindefekt. Lårbenene på den opererte siden av rottene ble deretter høstet på flere tidspunkter etter operasjonen (0 dager, 2 uker, 4 uker og 6 uker). Helingsprosessen til hver prøves defektområde ble evaluert ved bruk av mikro-CT, hematoksylin og eosin (H&E) farging og Masson trikrom farging. Disse resultatene viste et helbredelsesmønster i samsvar med intramembranøs forbening, med helbredelse i hovedsak fullført etter 6 uker. Kategoriseringen av denne dyremodellens helingsprosess gir en effektiv in vivo-metode for å undersøke nye biomaterialer og legemidler som retter seg mot intramembranøs ossifikasjon under heling av beinvevsdefekter.
Introduction
Brukket og defekt bein skyldes ofte traumer, svulster, betennelser og medfødte misdannelser 1,2. Selv om beinvev hos unge friske individer vanligvis har robuste regenerative evner3, kan defekter som overstiger en kritisk størrelse eller helbredelseshindringer på grunn av systemiske sykdommer (f.eks. diabetes, osteoporose og infeksjoner) fortsatt føre til komplikasjoner som beindiskontinuitet eller nedsatt tilheling4. For å løse denne kliniske utfordringen brukes beintransplantasjon eller biomaterialer ofte for å erstatte alvorlig defekt bein eller for å rekonstruere store beinsegmenter. Disse behandlingene har imidlertid begrensninger. For eksempel, selv om den regnes som gullstandarden, lider autolog beintransplantasjon av begrenset donorforsyning og potensielle komplikasjonerpå donorstedet 5,6. Allotransplantater utgjør også visse risikoer, som immunmediert avstøtning, potensiell overføring av sykdommer og negative innvirkninger på transplantatets biomekaniske og biologiske egenskaper7.
De siste årene har vært vitne til en økning i forskning med fokus på helingsmekanismer for beindefekter. Bruken av alternative biomaterialer og fremskritt innen vevsteknikk har dukket opp som fremtredende temaer innenfor domenet beinregenerering8. Før disse biomaterialene kan brukes til human terapi, må de testes in vitro og in vivo for å sikre deres effektivitet og sikkerhet. Den reduserte kompleksiteten til in vitro-miljøer og fraværet av immun- og inflammatoriske responser begrenser imidlertid evalueringen av ulike biomaterialer in vitro. Følgelig er det nødvendig å etablere dyremodeller for ulike typer beinvevsdefekter9. Dyremodeller tillater evaluering av biomaterialer under forskjellige belastningsforhold, letter forståelsen av artsspesifikke beinegenskaper og gir innsikt i likheten mellom dyremodeller og menneskelige kliniske situasjoner. Disse fordelene er avgjørende for å studere bein-stillas-interaksjoner og oversette forskningsfunn til klinisk praksis 9,10.
For tiden er mekaniske beindefektdyremodeller mye brukt for å validere ytelsen til biomaterialer, med kraniale beindefektmodeller og segmentelle beindefektmodeller som de mest brukte metodene11. Segmentelle bendefektmodeller, ofte brukt til å etterligne alvorlige lange bein- eller tibialtraumer som ender i benløsforening, er fordelaktige på grunn av deres ensartede dimensjoner og definerte anatomiske posisjoner, noe som forenkler radiologiske eller histologiske evalueringer av ny beindannelse og revaskularisering. Imidlertid krever disse modellene metallimplantater for å stabilisere bilaterale bruddsegmenter og nødvendiggjør en kompleks helingsprosess som involverer både endokondral og intramembranøs ossifikasjon12. På den annen side har calvariale bendefektmodeller blitt et primært screeningverktøy for evaluering av biomaterialer på grunn av deres standardiserte defektdiametre, praktiske kirurgiske tilgang og den støttende funksjonen til dura mater og bløtvev13. Selv om de er mye brukt til modellering av intramembranøs beindannelse i klinisk relevante scenarier, er de uegnet for å evaluere beinheling under biomekaniske belastningsforhold på grunn av deres ikke-bærende natur under helingsprosessen14.
For å adressere disse begrensningene etablerte vi en boks-hulrom kortikal beindefektmodell i lårbensdiafysevevet til rotter. Ved å bruke mikrocomputertomografi (CT), tredimensjonal (3D) rekonstruksjon og histopatologisk farging (hematoksylin og eosin [HE] og Masson), analyserte vi helingsprosessen til denne modellen under hemostaseforhold. Vi tar sikte på å tilby ny innsikt for å evaluere biomaterialers ytelse under biomekaniske belastningsforhold og for å studere bioengineering og mekanisme for beinregenerering vis-à-vis intramembranøs ossifikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer i denne studien ble gjennomgått og godkjent av den etiske komiteen ved West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-597). Sprague-Dawley-rotter (hannrotter, kroppsvekt 300 g) ble brukt til denne studien.
1. Prekirurgisk forberedelse
- Forberedelse av instrumenter
- Se figur 1A for de kirurgiske instrumentene som ble brukt i denne studien: elektrisk barbermaskin, vevssaks, oftalmisk saks, oftalmisk tang, engangsskalpell, periosteal separator, oralt lavhastighetshåndstykke, oral sonde, engangsvanningsstøvsuger, nåleholder, 3.0 sutur.
- Forbered en oral sonde og merk den store buede enden av sonden med en markørpenn i henhold til diameteren på defekten (figur 1B). Bruk dette til å bestemme størrelsen på defekten under operasjonen.
- Steriliser alt kirurgisk materiale og instrumenter som brukes til å utføre prosedyren før bruk. Pakk de ønskede materialene i brettet klut eller innpakningspapir og forsegl dem med autoklavtape for dampsterilisering (125-135 °C i 20-25 min).
- Forberedelse av operasjonsområdet: Desinfiser operasjonsbordet og miljøet rundt bordet ved å spraye med 75 % alkohol. Lag et sterilt område på ca. 60 cm x 90 cm med autoklaverte gardiner på operasjonsbordet.
- Forberedelse av anestesi
- Bedøve rottene intraperitonealt med 10 % ketaminhydroklorid (50-100 mg/kg) og 2 % xylazin 2 mg/kg). Bruk subkutan injeksjon av karprofen (5 mg/kg) for preoperativ og intraoperativ analgesi. Undersøk dybden av anestesi ved tåklemmetest. Etter anestesi, påfør steril øyesalve på øynene for å forhindre tørre øyne og hornhinneskade.
2. Kirurgisk prosedyre
- Plasser rotta i en lateral liggende stilling på det sterile operasjonsbordet og fjern hårene i underekstremitetene med en barbermaskin.
- Bruk 5 % jodforoppløsning og 75 % alkohol for å desinfisere hudvevet i operasjonsområdet.
- Finn det proksimale og distale lårbenet og gjør et snitt på 2,5 cm langs lårbenets lange akse for å skjære gjennom hudvevet til rotten.
- Skill hudlaget fra fascien med oftalmisk tang og vevssaks, og eksponer den laterale tilnærmingen til lårbenet gjennom biceps femoris og laterale lårmuskler.
- Finn skjæringspunktet mellom de to muskelskilleveggene (en hvit vevslinje) og separer forsiktig med et engangskirurgisk blad langs muskelgrensen til lårbensoverflaten er nådd.
NOTAT: Når du bruker et engangsblad for å skille muskelen, er det viktig å skille langs muskelskilleveggen og være forsiktig med å forårsake vaskulær skade i bløtvevet. Nybegynnere og de som ikke er kjent med anatomien må bruke oftalmisk tang og periosteale separatorer i stump disseksjon mellom de to muskelmassene.
- Påfør en periosteal separator for å skille lårbensoverflatens muskler stumt og avsløre midten av lårbensdiafysen.
- Bruk en steril markørpenn for å markere området av defektstedet på midten av lårbensdiafysen, plassert på toppen av den laterale 1/3 skrå kammen av lårhodet.
- Bruk det orale lavhastighetshåndstykket med en 1.2 mm diameter saktefilmkulebor for å bore et lite hull vinkelrett på beinoverflaten på det merkede stedet, og ødelegge periosteum og beinbarken med en dybde dyp nok til å nå benmargshulen. På dette boredybdenivået utvider du størrelsen på hullet parallelt med denne dybden i alle retninger, og trimmer for å oppnå en bokshulromsform.
- Bruk en merket oral sonde parallelt med kanten av defekten for å bestemme defektdiameteren og morfologien under og etter klargjøring.
- Lukk muskel- og hudlagene med henholdsvis 3-0 monofilament absorberbare suturer, og desinfiser operasjonsområdet med 5 % jodofor fra innsiden og ut.
3. Postoperativ omsorg
- Etter operasjonen, administrer karprofen (5 mg/kg) subkutant og legg rotta på en varmepute med konstant temperatur til restitusjon fra anestesi. Når rotta gjenvinner bevisstheten, flytt den forsiktig til et bur som inneholder tørt, autoklavert sengetøy.
- Fortsett analgesi i 24 timer og postoperativ overvåking i 1 uke etter operasjonen.
4. Prøveinnsamling og analyse
- Avlive rotta menneskelig etter operasjonen ved å injisere pentobarbitalnatrium 100-200 mg/kg intraperitonealt. Skill forsiktig muskel- og fascievevet på overflaten av lårbenet og fjern lårbenet på den opererte siden helt. Samle prøver etter 0 dager (figur 2A, B), 2 uker, 4 uker og 6 uker postoperativt.
- Fest lårbensprøvene i 4% paraformaldehyd i 24 timer. Analyser strukturen til femora ved å bruke mikrocomputertomografi. Still inn skanneparametrene som følger: Røntgenrørpotensial, 70 kVp; filter, AL 0,5 mm; Røntgenintensitet, 0,2 mA; voxel størrelse, 17 μm; og integrasjonstid, 1 × 300 ms. Rekonstruer 3D-modellbilder ved hjelp av punktgrafikkdata.
- Avkalk prøvene i 10 % EDTA i 8 uker før du dehydrerer lårbensprøvene i en gradert serie etanolfortynninger. Legg deretter prøvene inn i parafinvoks15.
- Skjær de innebygde prøvene i 5 μm parafinseksjoner fra sagittalplanet.
- Beis seksjoner med både et hematoksylin- og eosin (H&E) fargesett og et Masson-fargesett. Observer helbredelsen av defektområdet ved histopatologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen etablerer vi vellykket en rotte-lårbensboks-hulromsdefektmodell med dimensjoner på 4,5 mm x 1,5 mm ved boring. For å analysere helingsprosessen samlet vi lårvevet på den opererte siden 0 dager, 2 uker, 4 uker og 6 uker etter operasjonen, som er de viktigste tidspunktene for endokondral ossifikasjon, intramembranøs ossifikasjon og beinremodellering under helingsprosessen av lårbenstraumer hos rotter2. På postoperativ dag 0 viste rekonstruksjon av 3D-modellen fra mikro-CT-bitmapdata at vi vellykket modellerte en bokshulromsdefekt i lårbenet med en størrelse på 4,5 mm x 1,5 mm dyp til marghulen (figur 3A). Resultater av mikro-CT viste mineralisert trabekulær beindannelse i det interstitielle rommet til den kortikale beindefekten 2 uker etter modellopprettelse (figur 3B). Overflaten av det nye benvevet i defektområdet viste modent, tett kortikalt bein, og trabekulært benvev var fortsatt synlig på medullærsiden 4 uker postoperativt (figur 3C). Etter 6 uker var defektområdet nesten sammensatt av modent, tett kortikalt bein, med bare en liten mengde trabekulært benvev igjen nær medullærsiden, noe som indikerer at defektområdet i utgangspunktet hadde grodd (figur 3D).
Vi analyserer også de innsamlede prøvene ved H&E-farging og Masson trikrom farging (figur 4). Resultatene viste at naivt trabekulært benvev ble dannet i defektområdet 2 uker postoperativt, og periosteum rundt defektområdet ble tykkere og forbundet med det nyfødte trabekulære beinvevet i defektområdet (figur 4A,A',B,B'). 4 uker etter at defekten ble opprettet, ble det dannet tett kortikaalt beinvev på overflaten av defektområdet og forbundet med det kortikale beinet på begge sider av defekten; trabekulært benvev ble resorbert kraftig på medullærsiden (figur 4C,C',D,D'). Det ble dannet modent kortikalt benvev i defektområdet, og det trabekulære benvevet på medullærsiden ble nesten fullstendig resorbert 6 uker postoperativt (figur 4E,E',F,F'), noe som indikerer at defektens tilhelingsprosess var tilnærmet fullført.
Figur 1: Instrumenter som kreves for å skape defekter. (A) Kirurgiske instrumenter. (1) Elektrisk barbermaskin; (2) Oftalmisk tang; (3) Oftalmisk saks; (4) Engangs skalpell; (5) Periosteal separator; (6) Muntlig lavhastighets håndstykke; (7) Modifisert oral sonde; (8) Engangs vanningsstøvsuger; (9) Nåleholder; (10) Vev saks; (11) 3.0 sutur. (B) Orale sonder merket med dimensjonene til defektdiameteren. Den store buede enden av den sterile engangssonden ble merket med en skala på 1,5 mm og 4,5 mm for intraoperativ måling av defektområdets diameter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologi av bokshuledefekten (dag 0). (A,B) Måling av dag 0 postkirurgiske prøver ved bruk av en modifisert oral sonde som ble brukt til å lage bokshuledefekten (4,5 mm x 1,2 mm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mikro-CT-analyse av tilhelingsprosessen i defektområdet. 3D-rekonstruerte bilder av defektområdet 0 dager, 14 dager, 28 dager og 42 dager etter operasjonen. (A) Langsgående plan . (B-D) Langsgående (venstre panel), sagittale (midt) og tverrsnitt (høyre panel) mikro-CT-bilder av tilheling av defektområdet etter 14 dager, 28 dager og 42 dager. Den gule stiplede boksen i A, B, C og D representerer defektområdet. Den gule stiplede linjen representerer kantene på defekten, og den gule pilen representerer det nye beinvevet i defektområdet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Histopatologiske resultater. (A-F) H&E og Masson farging av defektområdet etter 14 dager, 28 dager og 42 dager. (A'-F') De zoomede bildene av de svarte rektangulære boksene vist i A-F. Trabekulært mineralisert beinvev ble dannet i defektområdet 14 dager etter operasjonen; kortikabelt beinvev ble dannet på overflaten av defektområdet og koblet til begge ender av defektområdet 28 dager etter operasjonen; modent kortikalt beinvev ble dannet i defektområdet 42 dager etter operasjonen, og tilhelingen var i utgangspunktet fullført. Den blå stiplede linjen indikerer kanten av defekten; området sirklet av den røde stiplede linjen er det nye beinvevet i defektområdet; den svarte pilen er det fortykkede periosteum; den gule trekanten er det gamle kortikale beinet; den grønne pilen er det nye trabekulære beinvevet; de svarte og gule stjernene er det nye kortikale beinvevet; og den røde pilen er det nye periosteum. Skalastenger: 500 μm (A-F), 200 μm (A'-F'). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prekliniske dyremodeller er avgjørende for å undersøke beinheling og påvirkningen av biomaterialer på beinregenerering. Denne protokollen illustrerer en lårbensboks-hulromsdefektmodell som replikerer den intramembranøse beindannelsesprosessen assosiert med klinisk beinregenerering. Defektområdet ble intraoperativt standardisert ved bruk av en forhåndsmerket oral sonde. Mikro-CT og histopatologiske fargeresultater viste progressiv tilheling over 6 uker, med fortykket periosteum og ny trabekulær beindannelse, etterfulgt av tett kortikal beindannelse. Det ble ikke observert bruskvev under tilhelingsprosessen, noe som indikerer intramembranøs osteogenese. Dette funnet presenterer nye perspektiver for å studere rollen til biomaterialer eller legemidler i klinisk beinregenerering.
Denne protokollen krever nøye oppmerksomhet til flere faktorer: (i) Dyp anestesi er en forutsetning for å forhindre dyreplager og sikre nøyaktig defektlokalisering. Anestesidybde og vitale tegn bør overvåkes nøye. (ii) Under muskelseparasjon bør det rettes nøye oppmerksomhet for å forhindre vaskulær skade, som kan hindre restitusjon. (iii) Når du forbereder defekthullet, hold høyre støttepunkt stabilt og alltid vinkelrett på beinoverflaten for å sikre at boksdefekten er på samme dybde. Boredybden bør kontrolleres for å fjerne kortikalt beinvev uten å gå for dypt. Dette unngår å forsinke beintilheling på grunn av overdreven mekanisk ødeleggelse av benmargen, noe som resulterer i fjerning av mesenkymale stamceller (MSC) og forstyrrelse av den inflammatoriske responsen16. (iv) Hulromsforberedelsen krever en assistent for kontinuerlig å vanne området med saltvann for å dempe potensiell vevsskade forårsaket av varme under beinablasjon samtidig som det kirurgiske feltets synlighet opprettholdes.
Benbrudd, segmentell beindefekt og kraniale beindefektmodeller er de mest brukte dyremodellene for å undersøke beinregenerering. Benbruddmodellen gjenspeiler selve traumeprosessen, men resultatene kan variere på grunn av forskjeller i bruddtverrsnitt mellomforsøksdyr 17. Den segmentelle bendefektmodellen simulerer effektivt bruddkomplikasjoner som ikke-forening eller forsinket tilheling. På grunn av sin anatomiske posisjonering letter denne modellen evalueringen av ny beindannelse og revaskularisering gjennom radiografiske eller histologiske metoder18. Imidlertid presenterer denne metoden betydelig variasjon i defektstørrelse blant forsøkspersoner; Kravet om skinnefiksering eller intern fiksering med metallimplantater begrenser også bruken11. Den calvariale defektmodellen er preget av ingen intern fiksering, høy reproduserbarhet i størrelse og anatomisk posisjon, og et stabilt mekanisk miljø14, noe som også begrenser applikasjonen ved evaluering av den biologiske responsen på fysiologisk, biomekanisk belastning av implantert materiale13. Dessuten, i fravær av et transplantatbein, kan invasjonen av defekten av dura mater og overliggende bløtvev hindre beinregenerering, noe som gjør disse modellene følsomme for ytelsen til stillasmaterialet18. Derfor foreslår denne protokollen etablering av en bokshulromsdefekt i rottens lårbensdiafyse, som muliggjør intraoperativ måling av defektdiameteren ved hjelp av et enkelt verktøy18. Denne tilnærmingen gir bedre kontroll over defektstandardisering enn brudd- eller segmentdefektmodellene og eliminerer behovet for intern eller ekstern fiksering. Videre er denne modellen robust mot svekkelse av beindannelse på grunn av bløtvevserosjon. Denne protokollen presenterer imidlertid visse begrensninger: (i) Feil utførelse eller for store defektdiametre kan føre til alvorlig blødning, sjokk eller til og med død hos rotter. For å sikre dyrenes sikkerhet og velferd er det derfor viktig å øve på rottekadavre før du utfører prosedyren på levende forsøkspersoner. (ii) Dessuten gjør fraværet av det aversianske systemet i gnagerbarken19 det vanskelig å fullstendig reprodusere den naturlige kliniske helingsprosessen av humant beinbrudd/defekt. Rotter, som gnagere, er kostnadseffektive, krever minimalt med vedlikehold og er trygge og enkle å håndtere, og gir høyere reproduserbarhet enn større dyr som kaniner, hunder og geiter20.
Oppsummert utviklet vi en rotte-lårbensdiafyse-boks-hulromsdefektmodell og sporet helingsprosessen ved å bruke mikro-CT og histopatologiske fargeteknikker. Denne protokollen gir en omfattende og generaliserbar metode for å granske intramembranøs beindannelse innenfor klinisk signifikante beinregenereringsmodeller. Videre foreslår den innovative perspektiver for biologisk ytelsesevaluering av erstatningsbiomaterialer, beinregenereringsassosierte legemidler, stillas, etc. Det letter også preklinisk validering av nye terapeutiske strategier for beinvevsteknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle originale data og bilder er inkludert i denne artikkelen. Forfattere oppgir ingen interessekonflikt
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) og 82100982 (F. L.), og støttet av Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mm slow speed ball drill | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | For preparation of box cavity defects |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suturing wounds |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | For fix the femoral specimens |
| Cotton balls | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | For skin sterilization and cleaning of surgical field |
| Cotton sticks | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | For skin disinfection |
| Dental technician grinding machine | Marathon | N3-140232 | For preparation of box cavity defects |
| Disposable scalpel | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue |
| Electric shaver | JASE | BM320210 | Removal of hair tissue from the surgical area |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | C1005 | For the histological analysis of the specimens |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | For the histological analysis of the specimens |
| Micro CT | Scanco medical ag | µCT 45 | For analyzing the healing of defects in femoral samples |
| Needle holder | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For suture-holding needles |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | For analyzing the results of HE staining and Masson staining |
| Ophthalmic forceps | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For clamping skin, muscle tissue |
| Ophthalmic scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
| Oral low-speed handpiece | Marathon | Y221101003 | For preparation of box cavity defects |
| Oral probe | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | For measuring the diameter of defects |
| Periosteal separator | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For blunt separation of muscle tissue |
| Sprague–Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | None | For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect |
| Tissue scissors | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | None | For forming a skin incision approach |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
- Holmes, D. Nonunion bone fracture: a quicker fix. Nature. 550 (7677), S193 (2017).
- Dimitriou, R., Jones, E., McGonagle, D., Giannoudis, P. V. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 9, 66 (2011).
- Schmidt, A. H. Autologous bone graft: Is it still the gold standard? Injury. 52 (Suppl 2). , S18-S22 (2021).
- Baldwin, P., et al. Autograft, allograft, and bone graft substitutes: Clinical evidence and indications for use in the setting of orthopaedic trauma surgery. J Orthop Trauma. 33 (4), 203-213 (2019).
- Muscolo, D. L., Ayerza, M. A., Aponte-Tinao, L. A. Massive allograft use in orthopedic oncology. Orthop Clin North Am. 37 (1), 65-74 (2006).
- Yu, Y., et al. Biomimetic periosteum-bone substitute composed of preosteoblast-derived matrix and hydrogel for large segmental bone defect repair. Acta Biomater. 113, 317-327 (2020).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: a review. Eur Cell Mater. 13, 1-10 (2007).
- McGovern, J. A., Griffin, M., Hutmacher, D. W. Animal models for bone tissue engineering and modelling disease. Dis Model Mech. 11 (4), dmm033084 (2018).
- Bigham-Sadegh, A., Oryan, A. Selection of animal models for preclinical strategies in evaluating the fracture healing, bone graft substitutes and bone tissue regeneration and engineering. Connect Tissue Res. 56 (3), 175-194 (2015).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Vajgel, A., et al. A systematic review on the critical size defect model. Clin Oral Implants Res. 25 (8), 879-893 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. A versatile protocol for studying calvarial bone defect healing in a mouse model. Tissue Eng Part C Methods. 23 (11), 686-693 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Sci Adv. 8 (29), eabn4977 (2022).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Bhandari, M., Shaughnessy, S. A minimally invasive percutaneous technique of intramedullary nail insertion in an animal model of fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 121 (10), 591-593 (2001).
- Muschler, G. F., Raut, V. P., Patterson, T. E., Wenke, J. C., Hollinger, J. O. The design and use of animal models for translational research in bone tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Part B Rev. 16 (1), 123-145 (2010).
- Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. Clifford, J., Rosen, M. D. , Wiley-Blackwell, UK. (2019).
- Wong, R. M. Y., et al. A systematic review of current osteoporotic metaphyseal fracture animal models. Bone Joint Res. 7 (1), 6-11 (2018).
